劉海嬌 楊小玉顧紅蕊 袁也 朱敏 郝莉雨 劉格 楊敏 張子龍

摘要：【目的】研究油菜揮發(fā)物對(duì)三七主要根腐病菌的抑制作用，為利用油菜與三七輪作或作為生物熏蒸材料控制三七根腐病害提供指導(dǎo)。【方法】利用揮發(fā)物收集裝置收集油菜莖和葉組織的揮發(fā)物，通過(guò)氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析油菜切段和研磨揮發(fā)物成分及相對(duì)含量；采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定油菜莖和葉揮發(fā)物及揮發(fā)物中硫醚類和異硫氰酸酯類化合物對(duì)3種根腐病菌（腐皮鐮刀菌F-3、惡疫霉菌D-1和銹腐病菌RS006）的抑菌活性。【結(jié)果】油菜莖和葉對(duì)F-3菌株的抑菌活性表現(xiàn)出低促高抑的濃度效應(yīng)，在最大用量2.0 g/皿時(shí)對(duì)D-1和RS006菌株的抑制率均大于65.00%。油菜切段揮發(fā)物的主要成分為二甲基二硫醚（相對(duì)含量55.86%），研磨的主要成分為葉醇（相對(duì)含量54.14%）等醇類物質(zhì)。硫醚類和異硫氰酸酯類化合物中的二甲基二硫醚（DMDS）、二甲基三硫醚（DMTS）和異硫氰酸烯丙酯（AITC）對(duì)三七根腐病菌均有抑菌活性，強(qiáng)弱順序?yàn)锳ITC>DMDS>DMTS。DMDS在濃度1200 mL/m3時(shí)對(duì)F-3、D-1和RS006菌株的抑制率分別為35.24%、73.23%和52.19%；DMTS在50 mL/m3時(shí)對(duì)F-3和RS006菌株的抑制率分別為61.55%和78.71%，對(duì)D-1菌株的抑制率為100.00%；AITC在8 mL/m3時(shí)對(duì)F-3和RS006菌株的抑制率為53.85%和79.39%，在2 mL/m3時(shí)即可完全抑制D-1菌株的生長(zhǎng)?！窘Y(jié)論】油菜揮發(fā)物中的DMDS、DMTS和AITC有較強(qiáng)的抑菌活性，利用油菜與三七輪作或?qū)ν寥肋M(jìn)行生物熏蒸以控制三七根腐病具有很大的開發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞： 油菜；揮發(fā)物；三七；根腐??；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S476.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）04-0695-08

Antimicrobial activities of Brassica campestris L. volatiles to Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen root rot pathogens

and chemical component analysis by GC-MS

LIU Hai-jiao1， YANG Xiao-yu1， GU Hong-rui2， YUAN Ye2， ZHU Min2， HAO Li-yu1，

LIU Ge1，YANG Min2*， ZHANG Zi-long1*

（1College of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102466， China； 2Key Laboratory for Agro-biodiversity and Pest Control of Ministry of Education， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract：【Objective】Inhibitory effects of Brassica campestris L. volatiles to major Panax notoginseng root rot pathogens were studied to provide guidance for controlling Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen root rot disease by B. campestris-P. notoginseng rotation or using B. campestris as biological fumigation materials. 【Method】Volatiles of B. campestris stem and leaves tissues were collected by volatile collection device， and the components and relative contents of volatiles from dissection and grinding tissues were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）. After that， the antifungal activity of volatiles from stems and leaves and sulfoether and isothiocyanate compounds in the voatiles against three root rot pathogens（Fusarium solani F-3， Phytophthora cactorum D-1 and Cylindrocarpon destructans RS006） were determined by hyphal growth rate method. 【Result】Low concentration of B. campestris stems and leaves promoted the activity of strain F-3， whereas high concentration inhibited its activity. The inhibitory rates against strains D-1 and RS006 were higher than 65.00% with the dosage of 2.0 g/dish. The main components of B. campestris dissection tissue volatiles was dimethyl disulfide（relative amount 55.86%）. The main components of B. campestris grinding tissue volatiles was 3-hexen-1-ol，（Z）-（relative amount 54.14%）. Dimethyl disulfide（DMDS），dimethyl trisulfide（DMTS） and allyl isothiocyanate（AITC）， which belonged to sulfoether and isothiocyanate， had antimicrobial activities against P. notoginseng pathogens， and the inhibitory activity order was as follows： AITC>DMDS>DMTS. The inhibitory rates of DMDS against strains F-3， D-1， and RS006 were 35.24%， 73.23% and 52.19% respectively at concentration of 1200 mL/m3. The inhibitory rates of DMTS against strains F-3 and RS006 were 61.55% and 78.71% at concentration of 50 mL/m3， and the inhibitory rate of DMTS against strain D-1 was 100.00% . The inhibitory rates of AITC against strains F-3 and RS006 were 53.85% and 79.39% at concentration of 8 mL/m3， and it completely inhibited the growth of strain D-1 at concentration of 2 mL/m3. 【Conclusion】DMDS， DMTS and AITC in the B. campestris volatiles inhibitoty effects on the pathogens. The results imply that B. campestris-P. notoginseng rotation or biological fumigation on soil could be dveloped as a method to control P. notoginseng root rot.

Key words： Brassica campestris L.； volatile； Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen； root rot； antimicrobial activity

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen]是我國(guó)特有的名貴中藥材，在治療心腦血管疾病方面療效顯著（李濤等，2015；楊春艷等，2016）。三七種植中連作障礙嚴(yán)重，尤其是土傳病害根腐病最突出，嚴(yán)重制約了三七種植業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展（楊永建等，2008；汪靜等，2015）。植物揮發(fā)物是植物與微生物間產(chǎn)生化感作用的重要物質(zhì)，部分植物揮發(fā)物可直接抑制病原菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)或誘導(dǎo)植物增強(qiáng)抗病性以減輕病害。油菜是最常用的生物熏蒸材料之一，其揮發(fā)產(chǎn)生的異硫氰酸酯類物質(zhì)對(duì)鐮刀菌（Fusarium）和疫霉（Phytophthora spp.）等多種重要土傳植物病原菌均有一定的抑制作用（張麗萍等，2017）。因此，探究油菜揮發(fā)物對(duì)三七根腐病菌的抑菌活性，對(duì)利用油菜與病原菌寄主植物輪作或進(jìn)行土壤生物熏蒸及推廣生態(tài)友好型病害控制方式具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】十字花科蕓薹屬植物是最常用的生物熏蒸材料，其細(xì)胞受損后產(chǎn)生揮發(fā)性的異硫氰酸酯類物質(zhì)（Isothiocyanates， ITCs）可抑制或殺死多種土傳植物病原菌（Sarwar et al.， 1998）。有研究報(bào)道，甘藍(lán)、芥藍(lán)、白花椰菜等蕓薹屬植物熏蒸對(duì)黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、水稻紋枯病菌、番茄立枯病菌和棉花枯萎病菌等多種病原菌有較好的抑制效果（李明社等，2006）。油菜（Brassica campestris L.）為蕓薹屬植物，油菜根茬粉碎還田后可使后作土壤中的細(xì)菌數(shù)量增加而真菌減少；油菜根茬的生物熏蒸作用可降低后作玉米絲黑穗病和紋枯病兩種土傳病害的發(fā)生率，同時(shí)有利于提高后作玉米產(chǎn)量（劉哲輝等，2017）。張麗萍等（2017）采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同油菜品種、不同部位硫苷含量及其對(duì)棉花黃萎病菌和紅腐病菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)油菜不同品種硫苷含量不等，同一品種的莖、根和籽中硫苷含量也存在差異，硫苷含量高的油菜品種晉黃芥對(duì)兩種病原菌的抑制活性更好?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，油菜作為熏蒸材料用于減輕三七根腐病的研究尚無(wú)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用菌絲生長(zhǎng)速率法，研究油菜揮發(fā)物對(duì)三七主要根腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析油菜揮發(fā)物的組成成分及相對(duì)含量，并測(cè)定其中硫醚類和異硫氰酸酯類化合物的抑菌活性，揭示油菜揮發(fā)物對(duì)三七根腐病菌的抑制效果及其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為利用油菜與三七輪作或作為生物熏蒸材料控制三七根腐病害提供參考。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

1. 1. 1 供試菌株 供試三七根腐病菌：腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）F-3、惡疫霉菌（Phytophthora cactorum）D-1和銹腐病菌（Cylindrocarpon destructans）RS006，均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1. 1. 2 供試植物材料 供試油菜（B. campestris L.）生長(zhǎng)時(shí)間約60 d，市售。

1. 1. 3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯去皮切塊后稱取200 g加水煮沸，雙層紗布過(guò)濾，濾液中加入葡萄糖和瓊脂各20 g，自來(lái)水定容至1 L；胡蘿卜培養(yǎng)基（CA）：胡蘿卜切塊后稱取200 g加水煮沸，組織搗碎機(jī)搗碎后4層紗布過(guò)濾，濾液中加入瓊脂20 g，自來(lái)水定容至1 L。配制好的培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min后倒成平板使用。PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)F-3和RS006，CA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)D-1。

1. 1. 4 供試試劑 二甲基二硫醚[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度98%]，二甲基三硫醚[梯希愛（日本）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度94%]，異硫氰酸烯丙酯（山東西亞化學(xué)股份有限公司，純度99%），次氯酸鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，有效氯≥10.0%），正己烷（Fisher Chemical，色譜純，純度99.9%），丙酮（默克股份兩合公司，色譜純，純度99.8%）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 油菜揮發(fā)物抑菌活性測(cè)定 取供試油菜地上部分，先用3%次氯酸鈉表面消毒3 mim，隨后用無(wú)菌水沖洗5次。莖和葉分開，分別切成1 mm3左右的小塊置于滅菌容器中備用。在制備好的培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的菌餅，在培養(yǎng)皿蓋上均勻鋪開供試植物組織。莖和葉分別設(shè)0.5、1.0和2.0 g/皿3個(gè)水平，以不放植物組織的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。封口膜密封培養(yǎng)皿后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)到培養(yǎng)皿直徑的2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率（楊敏等，2013）。病原菌生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落平均直徑-處理菌落平均直徑）/對(duì)照菌落平均直徑×100。

1. 2. 2 供試植物揮發(fā)物收集 利用自制收集裝置收集供試植物揮發(fā)物。收集裝置由裝有活性炭和變色硅膠的玻璃管、干燥缸、裝有吸附樹脂（PoraPakTM Q 80-100）的吸附柱、氣體采樣儀及連接各部件的軟管組成。將植物組織置于干燥缸中，缸蓋兩側(cè)打2個(gè)小孔，一端連接吸附柱和氣體采樣儀，另一端連接裝有變色硅膠和活性炭的玻璃管。放入植物組織并密封干燥缸后打開氣體采樣儀進(jìn)行抽氣，空氣經(jīng)活性炭吸附雜質(zhì)后進(jìn)入變色硅膠吸收水分，然后進(jìn)入干燥缸?？諝饨?jīng)干燥缸后攜帶揮發(fā)物進(jìn)入吸附柱并在此吸附揮發(fā)物，然后進(jìn)入氣體采樣儀并泵出空氣。

通過(guò)獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，油菜莖和葉的抑制效果僅對(duì)F-3菌株具有顯著差異（P<0.05，下同），對(duì)D-1和RS006菌株的抑制效果差異均不顯著（P>0.05，下同），因此，收集揮發(fā)物時(shí)莖葉合并收集。為最大限度收集油菜揮發(fā)的化感物質(zhì)，本研究設(shè)2種組織處理方法：一是模擬油菜在生長(zhǎng)中的自然揮發(fā)，將莖葉切成2 cm左右長(zhǎng)段；二是模擬油菜細(xì)胞受損發(fā)生水解反應(yīng)，將莖葉磨成勻漿。每種處理方式設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)油菜莖葉用量為3 kg，連續(xù)收集24 h后取下吸附柱。用正己烷洗脫、氮吹濃縮后過(guò)0.22 μm濾膜，裝入樣品瓶利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津GCMS-QP2010 ultra）進(jìn)行檢測(cè)。

1. 2. 3 揮發(fā)物成分分析儀器與條件 GC條件：SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）。起始柱溫40 ℃，以3.0 ℃/min升溫至80.0 ℃后，以5.0 ℃/min升溫至260.0 ℃，保持30.00 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度250.0 ℃，進(jìn)樣量2.0 μL，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比10∶1。MS條件：EI電離源，離子源溫度230.0 ℃，接口溫度250.0 ℃，掃描范圍35～500 m/z，采集方式Scan，掃描間隔0.30 s。揮發(fā)物成分鑒定通過(guò)NIST14s譜圖庫(kù)檢索保留時(shí)間，通過(guò)峰面積的百分比確定化合物的相對(duì)含量。

1. 2. 4 硫醚類和異硫氰酸酯類化合物抑菌活性測(cè)定 硫醚類和異硫氰酸酯類化合物是蕓薹屬植物生物熏蒸的主要物質(zhì)，根據(jù)GC-MS分析結(jié)果從油菜揮發(fā)物中選取含量較高的硫醚類和異硫氰酸酯類化合物，購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定其對(duì)三七根腐病菌的抑制活性。將1.5 mL離心管的蓋子剪下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，在制備好的培養(yǎng)基中央接種直徑5 mm的菌餅，把滅菌后的離心管蓋子放于培養(yǎng)皿蓋的中央，將揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品加到離心管蓋子中，以不加標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品添加量先設(shè)為200、400、800和1200 mL/m3；若完全抑制病原菌生長(zhǎng)，則依次降低濃度，每處理4次重復(fù)。培養(yǎng)條件及抑制率計(jì)算方法同1.2.1。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010及SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 油菜揮發(fā)物的抑菌活性測(cè)定結(jié)果

油菜對(duì)3種根腐病菌的抑菌活性見表1。從表1可看出，油菜莖和葉對(duì)3種病菌的抑菌活性均隨用量的增加而增強(qiáng)，在最大用量2.0 g/皿時(shí)，對(duì)3種病原菌的抑制率均顯著高于較低用量（0.5和1.0 g/皿）。在本研究設(shè)置水平下，油菜莖和葉對(duì)F-3菌株及油菜葉對(duì)RS006菌株的抑制率表現(xiàn)出低促高抑的濃度效應(yīng)，即在最低用量0.5 g/皿時(shí)對(duì)病原菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，當(dāng)用量增加到1.0和2.0 g/皿時(shí)對(duì)病原菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)為抑制作用。油菜莖和葉在最高用量2.0 g/皿時(shí)對(duì)D-1和RS006菌株的抑制率較高，均在65.00%以上；對(duì)F-3菌株的抑制率較低，分別為18.23%和40.84%。綜合3個(gè)用量來(lái)看（表2），油菜莖和葉對(duì)D-1和RS006菌株的抑制效果差異不顯著，對(duì)F-3菌株的抑制效果差異顯著。

2. 2 油菜揮發(fā)物GC-MS分析結(jié)果

2. 2. 1 油菜切段揮發(fā)物的化學(xué)成分 從油菜切段揮發(fā)物中共鑒定出17種化合物（篩選相似度在80%以上），包括醚類、苯環(huán)類、萜類、酯類、醇類、烯烴類和烷烴類共7類物質(zhì)。其中，醚類為硫醚類化合物只有1種物質(zhì)，即二甲基二硫醚，其相對(duì)含量為55.86%；其次為苯環(huán)類化合物，包含3種物質(zhì)，以鄰二甲苯的含量相對(duì)較高（2.49%）；萜類化合物包含4種物質(zhì)；酯類和醇類化合物均各有1種物質(zhì)，相對(duì)含量分別為2.34%和2.09%；含量較低的烯烴類和烷烴類化合物分別有2種和5種物質(zhì)，除1-十一烯相對(duì)含量為1.93%外，其余6種物質(zhì)含量均在0.50%以下（表3）。

2. 2. 2 油菜研磨揮發(fā)物的化學(xué)成分 從油菜研磨揮發(fā)物中共鑒定出48種化合物（篩選相似度在80%以上），包括醇類、醚類、酯類、烷烴類、酮類、醛類、烯烴類、苯環(huán)類、萜類及其他。剔除相對(duì)含量<0.10%的13種化合物，列出余下的33種化合物（表4）。其中，醇類化合物種類最多，相對(duì)總含量也最高，達(dá)83.86%；醚類包含4種化合物，又可分為氧醚類和硫醚類兩個(gè)小類，分別包含2種化合物；酯類包含4種化合物，可分為異硫氰酸酯類和羧酸酯類兩個(gè)小類，分別包含2種化合物；烷烴類有6種化合物，剩余酮類、醛類、烷烴類、烯烴類、苯環(huán)類和萜類化合物種類較少且相對(duì)含量較低；其他類包含5-己腈、甲代烯丙基氰、2-丁基四氫呋喃和1，1-[乙基茚雙氧]二-3[-己烯]，以5-己腈的相對(duì)含量較高，為5.37%。

2. 2. 3 油菜不同處理方式揮發(fā)物比較 油菜切段和研磨得到的揮發(fā)物種類和相對(duì)含量差異明顯，切段揮發(fā)物以二甲基二硫醚為主，研磨揮發(fā)物以葉醇等醇類為主，研磨處理得到的揮發(fā)物種類較切段處理多。兩種不同處理方式檢測(cè)到6種相同的揮發(fā)物單體，分別為二甲基二硫醚、乙酸葉醇酯、鄰二甲苯、二丙酮醇、（+）-檸檬烯和正十六烷，除二丙酮醇和正十六烷的相對(duì)含量接近外，其余4種化合物研磨處理的含量均高于切段處理。油菜揮發(fā)物中共檢測(cè)到2種硫醚化合物，分別為二甲基二硫醚（Dimethyl disulfide，DMDS）和二甲基三硫醚（Dimethyl trisulfide，DMTS）；共檢測(cè)到2種異硫氰酸酯類化合物，分別為3-丁烯基異硫氰酸酯和異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate，AITC）。與切段處理方式比較，研磨過(guò)程中揮發(fā)物損失更多；研磨處理的揮發(fā)物會(huì)快速釋放，而切段處理的揮發(fā)物釋放較慢；研磨后的揮發(fā)物因破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶的作用，產(chǎn)生物質(zhì)種類更多，因此兩種方式得到的揮發(fā)物種類和含量存在明顯差異。

2. 3 硫醚類和異硫氰酸酯類化合物抑菌活性測(cè)定結(jié)果

測(cè)定DMDS、DMTS和AITC對(duì)三七主要根腐病原菌F-3、D-1和RS006的抑菌活性，結(jié)果（圖1～圖3）顯示，3種化合物在本研究所設(shè)濃度下均有抑菌活性，且抑制率均隨使用濃度的增加而顯著升高。DMDS設(shè)計(jì)抑菌濃度為200～1200 mL/m3，且最高濃度對(duì)3種三七根腐病原菌的抑制率均顯著高于最低濃度的抑制率，其中1200 mL/m3濃度處理對(duì)D-1菌株的抑制率最高，為73.23%；其次為RS006菌株，抑制率為52.19%；最低的為F-3菌株，抑制率為35.24%（圖1）。DMTS的抑菌活性較DMDS強(qiáng)，200 mL/m3濃度下即完全抑制病原菌生長(zhǎng)，因此設(shè)計(jì)抑菌濃度降為20～50 mL/m3，在最低濃度下對(duì)3種病原菌的抑制率均在20.00%以上；在最高濃度下對(duì)F-3、D-1和RS006菌株的抑制率分別為61.55%、100.00%和78.71%（圖2）。AITC的抑菌活性強(qiáng)于DMDS和DMTS，在20 mL/m3濃度下即完全抑制3種病原菌生長(zhǎng)，因此設(shè)計(jì)抑菌濃度降低為2～8 mL/m3，在此濃度下對(duì)F-3菌株的抑制率為10.41%～53.85%，對(duì)RS006菌株的抑制率為29.65%～79.39%，對(duì)D-1菌株的抑制率在濃度為2 mL/m3時(shí)即達(dá)100.00%（圖3）。

3 討論

油菜揮發(fā)物對(duì)三七根腐病的主要病原菌具有化感抑制作用，且隨著用量的增加抑菌活性增強(qiáng)，表明實(shí)際生產(chǎn)中利用與油菜輪作或進(jìn)行生物熏蒸能抑制三七根腐病從而緩解三七連作障礙，合理密植或作熏蒸材料翻埋進(jìn)土壤中效果可能更佳。目前，利用蕓薹屬植物作為生物熏蒸材料防治作物土傳病蟲害已成為美國(guó)、澳大利亞、英國(guó)等多個(gè)國(guó)家的研究熱點(diǎn)，生物熏蒸技術(shù)已在一些國(guó)家和地區(qū)得到大面積推廣應(yīng)用。實(shí)際生產(chǎn)中以二道眉芥菜作為熏蒸材料處理多年連作茄子的土壤后，茄子黃萎病的發(fā)病率、病情指數(shù)及防控效果分別為30.8%、10.4%和65.8%，且茄子產(chǎn)量較空白對(duì)照增產(chǎn)35.4%；60000～75000 kg/ha的鮮油菜熏蒸土壤結(jié)合澆水450 m2/ha并覆膜處理，對(duì)棉花立枯病和黃萎病的防治效果均在60.0%以上（張麗萍等，2015；李淑敏等，2017）?；谇叭说难芯?，利用油菜防治三七根腐病害具有一定的可行性，但尚未見報(bào)道。因此，本研究選用云南常見蔬菜油菜作為試驗(yàn)材料，可為菜藥輪作或生物熏蒸減輕藥材的土傳病害提供思路。

蕓薹屬植物生物熏蒸效果顯著的物質(zhì)基礎(chǔ)為異硫氰酸酯類物質(zhì)（ITCs），油菜研磨后揮發(fā)物中含有兩種此類物質(zhì)，分別為AITC和3-丁烯基異硫氰酸酯（4-isothiocyanato-1-butene）。蕓薹屬植物葉片組織中AITC濃度達(dá)0.10 mg/g時(shí)可抑制接骨木鐮刀菌的生長(zhǎng)，且AITC濃度與真菌的生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)（Mayton et al.，1996）；而黑芥和芥菜葉片組織中AITC含量高于1.2 mg/g可抑制茄病長(zhǎng)蠕孢和大麗輪枝菌的生長(zhǎng)（Olivier et al.，1999）。同時(shí)，AITC對(duì)根結(jié)線蟲及雜草有較強(qiáng)的殺傷力（馬承鑄等，2009）。擬南芥外源施用AITC，會(huì)通過(guò)產(chǎn)生活性氧、一氧化氮和提高胞內(nèi)Ca2+濃度誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，且該誘導(dǎo)效應(yīng)是由茉莉酸甲酯啟動(dòng)。AITC誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉一方面降低了水分的散失，另一方面阻止了真菌通過(guò)氣孔侵染植物（Khokon et al.， 2011）。在本研究中，AITC濃度在8 mL/m3時(shí)對(duì)F-3和RS006菌株的抑制率分別為53.85%和79.39%，在濃度為2 mL/m3時(shí)完全抑制D-1菌株的生長(zhǎng)，表明AITC的抑菌活性極強(qiáng)，對(duì)D-1菌株的抑菌濃度范圍尚需進(jìn)一步探究。

油菜切段揮發(fā)物的主要成分為DMDS，其相對(duì)含量為55.86%。硫醚類化合物是一種新型的土壤熏蒸劑，而DMDS是最常用的硫醚類土壤熏蒸劑之一。DMDS作為西紅柿溫室的土壤熏蒸劑使用，在較低用量（56.4 g/m2）下即能大幅降低尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的數(shù)量，且可以維持整個(gè)生育期（Papazlatani et al.，2016）；DMDS與棉隆混合使用（30 g/m2+25 g/m2）作為溴甲烷的替代品在種植黃瓜的土壤中施用，可有效抑制根結(jié)線蟲，并能大幅減少鐮刀菌和疫霉的菌落形成，黃瓜產(chǎn)量亦維持在較高水平（Mao et al.， 2014）。此外，DMDS熏蒸不會(huì)影響有益微生物的活性（Dangi et al.，2014）。在本研究中，DMDS對(duì)3種根腐病菌均有抑菌活性，且隨著用量的增加抑菌活性增強(qiáng)。但3種病原菌的敏感性不同，因此，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況確定DMDS的用量。DMDS的抑菌活性弱于DMTS和AITC，但在切段揮發(fā)物中含量較高，為55.86%；AITC的抑菌活性最強(qiáng)，但在研磨揮發(fā)物中含量較低，僅為0.34%。因此，油菜作為熏蒸材料處理三七連作土壤時(shí)，尚需考察植物組織不同粉碎程度的熏蒸效果，尋找最適處理方式。

本研究將切碎（1 mm3左右）的油菜組織加入培養(yǎng)基中作揮發(fā)物抑菌試驗(yàn)，理論上既有植物組織自然揮發(fā)的物質(zhì)又有組織破碎后水解產(chǎn)生的物質(zhì)，因此，油菜揮發(fā)物抑制3種病原菌生長(zhǎng)的物質(zhì)應(yīng)該主要為DMDS、DMTS和AITC等化合物，除此之外，含量較高的葉醇等多用于食品和化妝品的調(diào)味方面，但未見抑菌報(bào)道（黃明泉等，2005），可能不是抑菌關(guān)鍵物質(zhì)。油菜因品種、采收時(shí)間、處理方式等差異，揮發(fā)物成分和種類差異明顯。已有的文獻(xiàn)中對(duì)油菜揮發(fā)物成分及種類研究較少，多集中于油菜中硫苷（李鋒等，2006；張麗萍等，2017）或油菜籽（唐瑩瑩等，2014）揮發(fā)油含量測(cè)定。本研究尚存在不足，如利用揮發(fā)物收集裝置收集揮發(fā)物時(shí)間僅24 h，收集到的揮發(fā)物十分有限，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后依據(jù)油菜鮮重計(jì)算，DMDS在切段揮發(fā)物中的收集率為0.2217‰，在研磨揮發(fā)物中的收集率為0.0025‰，DMTS在研磨揮發(fā)物中的收集率為0.0109‰，AITC在研磨揮發(fā)物中的收集率為0.0860‰。此外，后續(xù)仍需考慮不同硫苷含量的油菜對(duì)病原菌影響的差異，同時(shí)增加油菜對(duì)三七連作土壤微生物群體的影響并開展田間試驗(yàn)加以驗(yàn)證。因抑菌試驗(yàn)中未設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，因此，油菜揮發(fā)物的抑菌活性是否優(yōu)于辣根素、大蒜素等常用于控制三七根腐病的熏蒸藥劑，尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

油菜莖和葉組織的揮發(fā)物對(duì)三七根腐病菌具有抑菌活性，通過(guò)GC-MS鑒定出的硫醚類和異硫氰酸酯類化合物抑菌效果較好，將油菜作為三七輪作植物或三七連作土壤生物熏蒸材料用以防治三七根腐病進(jìn)而減輕或緩解三七連作障礙具有很大的開發(fā)潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）