甘隆 盧海慶 李生華 溫濟勇 趙育青 劉寶利

【摘要】目的探討核糖核酸結(jié)合基序蛋白8A （RBM8A）在膀胱尿路上皮癌中的表達及其意義。方法收集120例膀胱尿路上皮癌組織、20例癌旁組織及10例正常膀胱黏膜組織，采用免疫組織化學(xué)染色檢測組織中RBM8A的表達，結(jié)合RBM8A表達強度分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果膀胱尿路上皮癌組織和癌旁組織的染色陽性率分別為64.2%、10.0%，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。TNM分期晚、腫瘤分化程度低的膀胱尿路上皮癌患者，其RBM8A表達陽性率較高（P均<0.05）。膀胱尿路上皮癌患者中，RBM8A蛋白表達陽性者術(shù)后中位無瘤生存時間為22.7個月，短于RBM8A蛋白表達陰性者的30.0個月。結(jié)論RBM8A在膀胱尿路上皮癌中表達增強，與不良預(yù)后相關(guān)，有望作為診斷膀胱癌的生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】膀胱尿路上皮癌；核糖核酸結(jié)合基序蛋白8A；免疫組織化學(xué)；臨床病理特征；預(yù)后

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression level and significance of RNA binding motif protein 8A （RBM8A） in bladder urothelial cancer. MethodsThe bladder cancer tissues were collected from 120 patients， para-cancerous tissues from 20 and normal bladder mucosal tissues from 10， respectively. The expression level of RBM8A in the tissues was detected by immunohistochemical staining. The relationship between the expression of RBM8A and clinicopathological features of patients was analyzed. ResultsThe positive rate of RBM8A in the bladder cancer tissues was 64.2%， significantly higher compared with 10.0% in the para-cancerous tissues （P<0.001）. Patients with advanced TNM stage and low degree of tumor differentiation had high positive rate of RBM8A （both P<0.05）. The tumor-free survival time in bladder urothelial cancer patients with high positive rate of RBM8A protein was 22.7 months， shorter than 30.0 months in their counterparts with negative rates of RBM8A protein. ConclusionsThe positive rate of RBM8A is up-regulated in patients with bladder urothelial cancer， which is correlated with poor prognosis. It is a promising biomarker for the diagnosis of bladder cancer.

【Key words】Bladder urothelial carcinoma； RNA binding motif protein 8A； Immunohistochemistry；

Clinicopathological feature； Prognosis

膀胱癌指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。膀胱癌患者的高發(fā)年齡是50～70歲，膀胱尿路上皮癌（TCCB）占膀胱癌患者總數(shù)的90%以上[1]。70%的患者初診時為非肌層浸潤性尿路上皮癌，局部治療有效，但仍有20%的患者進展為肌層浸潤性尿路上皮癌。另外25%的患者在初診時即為肌層浸潤性尿路上皮癌，5%患者合并遠處轉(zhuǎn)移，對于局部晚期和遠處轉(zhuǎn)移的患者，現(xiàn)有治療方案效果欠佳，5年生存率大約為15%[2]。隨著人類基因組學(xué)研究的逐漸深入，特定的分子和基因標(biāo)志物正逐漸取代常規(guī)的細胞和組織病理成為惡性腫瘤具體分型的依據(jù)，這樣更有利于揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展的病理生理過程，尋找針對性更強的診療方案。核糖核酸結(jié)合基序蛋白8A（RBM8A）基因可通過調(diào)控不同 mRNA 的剪切拼接，參與RNA代謝的多方面功能，對細胞生長、分化、凋亡等過程產(chǎn)生廣泛影響[3]，其功能異常直接導(dǎo)致細胞增殖分化障礙?，F(xiàn)有研究表明，RBM8A在多種腫瘤中呈高表達[4]。目前尚無RBM8A在膀胱惡性腫瘤中相關(guān)研究，筆者在查詢Oncomine數(shù)據(jù)庫時發(fā)現(xiàn)，RBM8A mRNA在多個膀胱癌組織中表達明顯升高。為進一步明確RBM8A與膀胱癌之間的相關(guān)性，本研究檢測了膀胱尿路上皮癌組織和非癌組織中RBM8A的表達，并分析其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，以探討RBM8A在膀胱癌發(fā)病過程中的作用。

對象與方法

一、研究對象

1.病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

包括：①2010年1月至2014年6月間在桂平市人民醫(yī)院住院經(jīng)病理確診且保留可供RBM8A檢測組織標(biāo)本的膀胱尿路上皮癌患者； ②年齡18～75歲，有完整的臨床資料；③美國東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）體能狀況評分≤2分；④無全身遠處器官轉(zhuǎn)移，無合并明顯的主要器官功能損害；⑤中性粒細胞>1.5×109/L，血紅蛋白≥80 g/L，血小板≥75×109/L，總膽紅素<1.5倍正常值，轉(zhuǎn)氨酶≤2.5倍正常值。

2.入組對象的一般資料

按上述標(biāo)準(zhǔn)共納入120例膀胱尿路上皮癌患者。其中男82例、女38例，年齡30～75歲、中位年齡65歲；臨床分期按AJCC-TNM標(biāo)準(zhǔn)，非浸潤性膀胱癌（Ta-T1） 75例、浸潤性膀胱癌（T2-T3） 45例；病理分級按WHO標(biāo)準(zhǔn)，G1 68例、G2～G3 52例。本研究經(jīng)桂平市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入組患者均簽署知情同意書。

3.病理標(biāo)本來源

收集上述膀胱尿路上皮癌患者在膀胱癌根治切除術(shù)后的病理蠟塊。另隨機抽取20例遠離腫瘤的癌旁組織和10例正常膀胱黏膜作為對照組。

二、檢測方法

1.主要檢測儀器

包括輪轉(zhuǎn)切片機（Rm2235，LEICA公司），烤箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），微量移液器（Eppendorf公司），顯微鏡（B×40型）（Olympus公司）和Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司）。

2.主要檢測試劑

一抗使用鼠抗人單克隆抗體RBM8A（Thermscientific公司），二抗使用免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）MaxVisionTM鼠/兔-辣根過氧化物酶（HRP）廣譜檢測試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）和二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

3.免疫組化檢測及結(jié)果判定

將組織石蠟切片按照說明書步驟染色、固定處理，封片后進行后續(xù)結(jié)果判定。RBM8A主要位于腫瘤細胞胞質(zhì)，呈深棕黃色或黃褐色顆粒狀染色。由2名中級或以上職稱的病理科醫(yī)師采用13點評分進行半定量分析：①按切片中顯色細胞數(shù)比例計分，無細胞顯色為0分、顯色細胞占細胞總數(shù)<10%為1分、顯色細胞占細胞總數(shù)10%～49%為2分、顯色細胞占細胞總數(shù)50%～79%為3分、顯色細胞占細胞總數(shù)≥80%為4分；②按切片中細胞顯色強度計分，細胞無顯色為0分、呈淺黃色（弱染色）為1分、呈棕黃色（中等染色）為2分、呈棕褐色（強染色）為3分?？偡譃轱@色細胞數(shù)與顯色強度評分的乘積，0～2分為陰性，大于2分者為陽性[5-6]。

三、隨訪方法

對120例膀胱尿路上皮癌患者進行隨訪分析，記錄其腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或患者死亡時間?；颊呦嚓P(guān)的隨訪資料通過電話收集，隨訪時間從治療結(jié)束出院開始計算，每例患者每半年通過電話隨訪1次，隨訪截止日期 為2017 年6 月1日，中位隨訪時間為48個月。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、 RBM8A蛋白在膀胱尿路上皮癌組織和癌旁組織中的表達：

免疫組化顯示，RBM8A在膀胱尿路上皮癌組織中呈高表達，主要位于腫瘤細胞胞質(zhì)，呈深棕黃色或黃褐色顆粒狀染色（圖1A）；癌旁組織染色較癌組織弱（圖1B）；正常膀胱黏膜組織染色均為陰性（圖1C）。膀胱尿路上皮癌癌組織和癌旁組織的染色陽性率分別為64.2%、10.0%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表1。

T2～T3期浸潤性膀胱癌患者以RBM8A陽性為主，達77.8%，Ta～T1期RBM8A陽性率僅占56.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；病理分級G2～G3患者中，RBM8A陽性率為76.9%，高于G1的54.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011）。另外，RBM8A表達水平與患者年齡和性別無關(guān)（P均>0.05），見表2。

三、RBM8A蛋白與浸潤性膀胱癌患者術(shù)后無瘤生存時間的相關(guān)性

最后一次隨訪結(jié)束時，75例淺表性膀胱癌的患者中，未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)55例，失訪10例； 45例浸潤性膀胱癌患者中，RBM8A表達陰性的10例中，未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)4例，RBM8A表達陽性的35例中，未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)3例，失訪4例。RBM8A蛋白表達陽性者術(shù)后中位無瘤生存時間為22.7個月，短于RBM8A蛋白表達陰性者的30.0個月，見圖2。

討論

RBM8A編碼4個轉(zhuǎn)錄子，在細胞內(nèi)廣泛表達，穿梭于胞漿和胞核內(nèi)。其作為外顯子拼接復(fù)合體（EJC）中的核心部件，作用是補充人類上游移碼突變體（hUpf）到EJC上，從而觸發(fā)無義介導(dǎo)mRNA降解（NMD），是NMD發(fā)生過程中必不可少的物質(zhì)[3]?；蚪M學(xué)技術(shù)的發(fā)展逐漸揭示了RBM8A基因與疾病的關(guān)系。以巨核細胞生成障礙導(dǎo)致血小板減少，伴雙側(cè)橈骨缺如和出血為主要臨床表現(xiàn)的血小板減少伴橈骨缺失綜合征（TAR）就是RBM8A基因突變引起的，主要機制之一就是造血細胞的分化成熟障礙，患兒同時也會表現(xiàn)出智力缺陷[7]。在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均發(fā)現(xiàn)RBM8A基因的異常表達[8]。Zou等[9]報道，RBM8A與神經(jīng)細胞的增殖分化密切相關(guān)。Silver等[10]發(fā)現(xiàn)，RBM8A可能通過破壞有絲分裂紡錘體的完整性，影響染色體的數(shù)目和基因組的穩(wěn)定性，干擾神經(jīng)系統(tǒng)的正常分化和發(fā)育。

近年研究發(fā)現(xiàn)，RBM8A在肝癌、非小細胞肺癌等多種癌組織中均呈高表達，并與腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)[6]。Ishigaki等[11]在對人宮頸癌細胞株（HeLa）及人肺腺癌細胞株（A549）的研究結(jié)果顯示，沉默RBM8A基因后，腫瘤細胞凋亡增加，增殖活性受抑制，細胞周期停滯在M期，有絲分裂速度減慢，腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為發(fā)生改變。既往研究顯示，腫瘤細胞的分化程度與其惡性程度密切相關(guān)，細胞分化程度越低，增殖越活躍，有絲分裂周期越短，惡性程度越高，因此預(yù)后越差。上述研究提示，RBM8A廣泛參與細胞生長、分化、凋亡等過程，與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中分化成熟障礙可能是RBM8A潛在的作用機制，值得進一步深入探索。

膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多階段、多步驟漸進演化過程，該過程涉及到眾多原癌基因的激活、腫瘤抑制基因的突變或失活、細胞凋亡機制紊亂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等多因素協(xié)同作用[12-13]。筆者查詢Oncomine數(shù)據(jù)庫（http：//www. oncomine.org）發(fā)現(xiàn)，RBM8A mRNA在多個膀胱癌組織中表達明顯升高，且與MTF2、CASP3、ERCC3和ATR等基因存在共表達關(guān)系。在GeneCars數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）中可知，MTF2主要影響組蛋白甲基化，處于細胞自我更新和分化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中；CASP3編碼的是與腫瘤凋亡密切相關(guān)的激酶蛋白；ERCC3和ATR編碼的是DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白。進一步查詢THE HUMAN PROTEIN ATLAS數(shù)據(jù)庫（https：//www. proteinatlas.org）發(fā)現(xiàn)MTF2、CASP3、ERCC3和ATR蛋白在多種惡性腫瘤中表達升高且與不良預(yù)后相關(guān)。本研究采用免疫組化檢測了膀胱尿路上皮癌組織和癌旁組織中RBM8A 的表達。結(jié)果顯示，在膀胱尿路上皮癌組織中RBM8A陽性率高于癌旁組織、正常膀胱黏膜組織。進一步研究結(jié)果顯示，腫瘤分化程度越低，RBM8A陽性率越高，浸潤性膀胱癌患者術(shù)后無瘤生存時間越短。

上述多項研究提示，RBM8A陽性表達與患者的不良預(yù)后直接相關(guān)，RBM8A可能參與膀胱癌發(fā)生過程的早期生物學(xué)事件，并在腫瘤的進程中起著重要的作用，但本研究僅檢測膀胱癌組織中RBM8A蛋白的表達，其具體作用和機制尚不清楚。后續(xù)研究將通過體內(nèi)細胞試驗和體外動物模型進一步深入探討RBM8A基因與膀胱癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系，尋找其發(fā)揮作用的信號通路和上下游的關(guān)鍵基因，以闡明其在惡性腫瘤中的生物學(xué)機制，為膀胱癌的早期診斷、靶向治療、預(yù)后判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測提供新的途徑。

參考文獻

[1]李遼源，吳杰英，劉紹遠，楊明，羅子寰，張凌霄，高新，孟占鰲. 膀胱尿路上皮癌組織中DACH2的表達及臨床意義.中華腔鏡泌尿外科雜志（電子版），2016，10（6）：415-419.

[2]National Cancer Institute Surveillance， Epidemiology， and End Results Program. SEER Stat Fact Sheets： Bladder Cancer.[2017-07-20].http：//seer. cancer. gov/statfacts/html/urinb. html.

[3]Chuang TW， Lee KM， Tarn WY. Function and pathological implications of exon junction complex factor Y14.Biomolecules，2015，5（2）：343-355.

[4]Chuang TW， Chang WL， Lee KM， Tarn WY.The RNA-binding protein Y14 inhibits mRNA decapping and modulates processing body formation. Mol Biol Cell，2013，24（1）：1-13.

[5]朱麗君. RNA結(jié)合基序蛋白8A在肝癌組織中的表達及意義. 廣西醫(yī)科大學(xué)， 2015.

[6]Liang R， Lin Y， Ye JZ， Yan XX， Liu ZH， Li YQ， Luo XL， Ye HH. High expression of RBM8A predicts poor patient prognosis and promotes tumor progression in hepatocellular carcinoma. Oncol Rep，2017，37（4）：2167-2176.

[7]Albers CA， Paul DS， Schulze H， Freson K， Stephens JC， Smethurst PA， Jolley JD， Cvejic A， Kostadima M， Bertone P， Breuning MH， Debili N， Deloukas P， Favier R， Fiedler J， Hobbs CM， Huang N， Hurles ME， Kiddle G， Krapels I， Nurden P， Ruivenkamp CA， Sambrook JG， Smith K， Stemple DL， Strauss G， Thys C， van Geet C， Newbury-Ecob R， Ouwehand WH， Ghevaert C.Compound inheritance of a low-frequency regulatory SNP and a rare null mutation in exon-junction complex subunit RBM8A causes TAR syndrome.Nat Genet，2012，44（4）：435-439， S1-S2.

[8]Nguyen LS， Kim HG， Rosenfeld JA， Shen Y， Gusella JF， La-cassie Y， Layman LC， Shaffer LG， Gécz J.Contribution of copy number variants involving nonsense-mediated mRNA decay pathway genes to neuro-developmental disorders.Hum Mol Genet，2013，22（9）：1816-1825.

[9]Zou D， McSweeney C， Sebastian A， Reynolds DJ， Dong F， Zhou Y， Deng D， Wang Y， Liu L， Zhu J， Zou J， Shi Y， Albert I， Mao Y.A critical role of RBM8a in proliferation and differentiation of embryonic neural progenitors.Neural Dev，2015，10：18.

[10]Silver DL， Watkins-Chow DE， Schreck KC， Pierfelice TJ， Larson DM， Burnetti AJ， Liaw HJ， Myung K， Walsh CA， Gaiano N， Pavan WJ.The exon junction complex component Magoh controls brain size by reg-ulating neural stem cell division.Nat Neurosci，2010，13（5）：551-558.

[11]Ishigaki Y， Nakamura Y， Tatsuno T， Hashimoto M， Shimasaki T， Iwabuchi K， Tomosugi N.Depletion of RNA-binding protein RBM8A （Y14） causes cell cycle deficiency and apoptosis in human cells.Exp Biol Med （Maywood），2013，238（8）：889-897.

[12]Kurtoglu M， Davarpanah NN， Qin R， Powles T， Rosenberg JE， Apolo AB. Elevating the horizon： emerging molecular and genomic targets in the treatment of advanced urothelial carcinoma. Clin Genitourin Cancer，2015，13（5）：410-420.

[13]葛曙雄， 王涌. 微小RNA與腫瘤微環(huán)境. 新醫(yī)學(xué)， 2016， 47（1）：7-11.