麥榮國(guó) 郭曉鑾 招麗娟 林家壽 劉少文 張建偉

摘要 目的：評(píng)價(jià)麻黃湯不同配伍對(duì)苦杏仁和甘草有效成分的影響。方法：制備苦杏仁苷對(duì)照品溶液和甘草酸單銨鹽對(duì)照品溶液和不同配伍方式的麻黃湯水煎液供試品溶液，以正交設(shè)計(jì)8中不同配伍的麻黃湯組方，苦杏仁有效成分研究中以A-H進(jìn)行標(biāo)識(shí);甘草有效成分研究中以A1-H1對(duì)8中不同配伍方式進(jìn)行標(biāo)實(shí)。最終結(jié)果根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)提出的中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A進(jìn)行相似度分析，采用MATLAB軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)。結(jié)果：苦杏仁和甘草色譜條件能夠分別將苦杏仁苷和甘草酸清晰的分離出來，無其他雜質(zhì)峰，基線穩(wěn)定，具有可比性。麻黃湯不同配伍方式中對(duì)苦杏仁有效成分苦杏仁苷每劑含量未見明顯差異，進(jìn)行方差分析后結(jié)果顯示，麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對(duì)苦杏仁苷的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。麻黃湯不同配伍方式中以H1單純甘草中甘草酸含量為最高，而麻黃湯全方A1中的甘草酸含量為最低;不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草酸的含量（P<0.05）。結(jié)論：麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對(duì)苦杏仁中有效成分苦杏仁苷未見明顯影響;而不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草有效成分甘草酸的含量。

關(guān)鍵詞 指紋圖譜;麻黃湯;不同配伍;苦杏仁;甘草;苦杏仁苷;甘草酸單銨鹽;高效液相色譜法

Study on the Effects of Different Compatibility of Mahuang Decoction on the Active Ingredients

of Semen Armeniacae Amarum and Radix Glycyrrhizae Based on Fingerprint

Mai Guorong， Guo Xiaoluan， Zhao Lijuan， Lin Jiashou， Liu Shaowen， Zhang Jianwei

（Preparation Center of Foshan Chinese Medicine Hospital， Foshan 528216， China）

Abstract Objective：To evaluate the effects of different compatibility of Mahuang decoction on the effective components of Semen Armeniacae Amarum and Radix Glycyrrhizae based on the fingerprint of Chinese herbal medicine. Methods：Amygdalin reference solution and glycyrrhizinic acid standard solution and the different combination of Mahuang decoction test solution were prepared. 8 types of different combinations of Mahuang decoction were orthogonally designed， and A-H mark was used to effective ingredients of Semen Armeniacae Amarum; A1-H1 was marked to active ingredients of Radix Glycyrrhizae in different combinations Mahuang Decoction. Finally， the similarity analysis was carried out， according to the similarity evaluation system 2004A of traditional Chinese medicine fingerprints proposed by the national pharmacopoeia committee， and the MATLAB software was used for data processing and statistics. Results：1） The chromatographic conditions of Semen Armeniacae Amarum and Radix Glycyrrhizae could separate the amygdalin and glycyrrhizic acid respectively. There was no other impurity peak， and the baseline was stable and comparable. 2） There was no significant difference in amygdalin of Semen Armeniacae Amarum in each different Mahuang decoction. The variance analysis showed that there was no significant difference （P>0.05） in Herba Ephedrae， Ramulus Cinnamomi， Radix Glycyrrhizae in Mahuang decoction with different compatibilities. 3） H1 with pure glycyrrhizin content was the highest in different combination of Mahuang Decoction， while the contents of A1 with glycyrrhizic acid in Mahuang decoction were the lowest. Herba Ephedrae， Ramulus Cinnamomi， Radix Glycyrrhizae in different combination of Mahuang Decoction decreased the content of glycyrrhizic acid in Mahuang decoction （P<0.05）. Conclusion：Herba Ephedrae， Ramulus Cinnamomi and Radix Glycyrrhizae in different compatibility of Mahuang decoction had little significant effects on almond amygdalin; and they all decreased the contents of effective components of licorice of glycyrrhizic acid.

Key Words Fingerprint; Mahuang decoction; Different compatibility; Semen Armeniacae Amarum; Radix Glycyrrhizae; Amygdalin; Mono ammonium salt of glycyrrhizic acid; HPLC

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.048

麻黃湯這一出自醫(yī)圣張仲景的著名經(jīng)典方劑，僅由四味藥組成，分別為麻黃、桂枝、苦杏仁、甘草;原文《傷寒論》中顯示麻黃湯用于太陽傷寒表實(shí)證，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度來說麻黃湯可用于治療上呼吸道感染、流感、急性支氣管炎、支氣管哮喘等疾病[1-4]。麻黃湯四味藥物共奏發(fā)汗解表的功效，其中麻黃的藥性屬辛溫，通過發(fā)汗將外邪驅(qū)逐出肌表衛(wèi)分;桂枝藥性辛溫，其色赤善發(fā)散可入營(yíng)分散寒入衛(wèi)分，而入衛(wèi)分的外邪再隨麻黃而出衛(wèi)分，邪祛疾病自愈;苦杏仁藥性屬苦溫，通過肅降肺氣，宣肺止咳;同時(shí)佐麻黃辛散;甘草調(diào)和諸藥，使諸藥合用邪氣祛解而正氣不傷[5-7]。而對(duì)于經(jīng)方的研究，研究學(xué)者多通過拆方研究配伍關(guān)系對(duì)中藥配伍的藥理研究探索其配伍的后藥物有效成分的變化，探討配伍意義[8]。目前麻黃湯中藥指紋圖譜的研究較少，我們基于指紋圖譜研究麻黃湯不同配伍對(duì)苦杏仁、甘草有效成分的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)：HP1100，美國(guó)惠普公司）;甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）等均購(gòu)自天津市康科德科技有限公司。

1.2 試劑

購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所的苦杏仁苷對(duì)照品（820-200002）和甘草酸單銨鹽（0731-9704）。

1.3 分析樣品

我院中藥房提供的麻黃科植物草麻黃的麻黃干燥草質(zhì)莖，樟科植物肉桂的桂枝干燥嫩技，薔薇科植物山杏的苦杏仁干燥成熟種子，豆科植物甘草的甘草干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 苦杏仁有效成分指紋圖譜色譜條件 本研究選擇Hypersil ODS-C18柱（4.0 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱;流動(dòng)相：甲醇-水（15∶85）作為流動(dòng)相溶劑條件進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣體積為10 μL控制35 ℃柱溫，并以0.5 mL/min為流速;以210 nm為目標(biāo)檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 甘草有效成分指紋圖譜色譜條件 本研究選擇Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱;流動(dòng)相：乙腈-1.5%醋酸水溶液梯度洗脫，進(jìn)樣體積2 μL維持和室溫相同的柱溫，并以0.8 mL/min為流速;以254 nm為目標(biāo)檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

2.2.1 苦杏仁苷對(duì)照品溶液制備 精密稱取12.5 mg苦杏仁苷對(duì)照品并加入50%甲醇將其定容與25 mL的容量瓶中，獲得0.503 mg/mL的苦杏仁苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 甘草酸單銨鹽對(duì)照品溶液制備 精密稱取20 mg甘草酸單銨鹽對(duì)照品并加入40%甲醇將其定容與25 mL容量瓶中，獲得1.01 mg/mL甘草酸單銨鹽對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 苦杏仁含量測(cè)定供試品溶液制備 根據(jù)表1中麻黃湯的不同配伍方式A-H組成含苦杏仁的8個(gè)配伍組方，先根據(jù)A-H組方分別稱量麻黃湯藥材（劑量同《傷寒論》所記載），由于苦杏仁后下，先將8個(gè)組方中的其他藥物先置于含有1 000 mL水的燒瓶中浸泡30 min，加熱煮沸30 min后加熱苦杏仁，繼續(xù)加熱回流20 min，搖勻過濾即得各不同配伍麻黃湯A-H的麻黃湯水煎液;精密量取0.5 mL上述麻黃湯水煎液加入甲醇定容于25 mL量瓶，靜置2 h后離心取上清液，即得各不同配伍含苦杏仁的A-H的麻黃湯供試品溶液。

2.3.2 甘草含量測(cè)定供試品溶液制備 根據(jù)表2中麻黃湯的不同配伍方式A1-H1組成含甘草的8個(gè)配伍組方，方法同1.4.1制備各不同配伍含甘草的A1-H1的麻黃湯供試品溶液。

表1 麻黃湯不同配伍研究苦杏仁有效成分的

正交設(shè)計(jì)（1=用藥，2=不用藥）

表2 麻黃湯不同配伍研究甘草有效成分的

正交設(shè)計(jì)（1=用藥，2=不用藥）

2.4 專屬性試驗(yàn)

取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用薄層層析的方法對(duì)麻黃湯進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示麻黃湯專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品的甲醇溶液3.0、6.0、12.0、18.0、24.0 mL，分別置50 mL量瓶中。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積;以混合對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，混合對(duì)照品在0.064 32～0.145 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 中間精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對(duì)標(biāo)注偏差RSD為0.82%，精度度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取麻黃湯全方的供試品溶液，分別根據(jù)苦杏仁的色譜條件和甘草的色譜條件進(jìn)行指紋圖譜研究，在供試品溶液制備后0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進(jìn)行測(cè)定，最終獲得苦杏仁色譜條件的RSD為1.88%;而甘草色譜條件的RSD為0.89%，表明24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定以及各色譜條件的穩(wěn)定性高。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測(cè)5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.88%，重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量的同一批號(hào)樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對(duì)照品甲醇溶液（0.005 36 mg/mL），進(jìn)行回收率試驗(yàn)測(cè)定，計(jì)算結(jié)果顯示平均回收率為98.54%，RSD為0.76%。

2.10 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10.1 麻黃湯中苦杏仁色譜條件的指紋圖譜

如圖1所示，苦杏仁色譜條件能夠?qū)⒖嘈尤受涨逦姆蛛x出來，無論是苦杏仁苷對(duì)照品溶液、缺苦杏仁陰性對(duì)照溶液還是麻黃湯全方供試品溶液均獲得清晰的分離，無其他雜質(zhì)峰，基線穩(wěn)定，具有可比性。

圖1 麻黃湯中苦杏仁色譜條件的指紋圖譜

2.10.2 甘草指紋圖譜

甘草色譜條件能夠?qū)⒖嘈尤受涨逦姆蛛x出來，無論是苦杏仁苷對(duì)照品溶液、缺苦杏仁陰性對(duì)照溶液還是麻黃湯全方供試品溶液均獲得清晰的分離，無其他雜質(zhì)峰，基線穩(wěn)定，具有可比性。見圖2。

圖2 麻黃湯中甘草色譜條件的指紋圖譜

2.10.3 麻黃湯不同配伍方式對(duì)苦杏仁有效成分的影響

麻黃湯不同配伍方式中對(duì)苦杏仁有效成分苦杏仁苷每劑含量未見明顯差異，進(jìn)行方差分析后結(jié)果顯示，麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對(duì)苦杏仁苷的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

圖3 麻黃湯不同配伍方式對(duì)苦杏仁有效成分的影響

表3 麻黃湯不同配伍方式對(duì)苦杏仁有效成分的影響

2.10.4 麻黃湯不同配伍方式對(duì)甘草有效成分的影響

麻黃湯不同配伍方式中以H1單純甘草中甘草酸含量為最高，而麻黃湯全方A1中的甘草酸含量為最低;不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草酸的含量（P<0.05）。見圖4和表4。

圖4 麻黃湯不同配伍方式對(duì)甘草有效成分的影響

表4 麻黃湯不同配伍方式對(duì)甘草有效成分的影響

3 討論

苦杏仁為薔薇科櫻桃屬植物山杏、薔薇科櫻桃屬植物西伯利亞杏、薔薇科櫻桃屬植物東北杏或薔薇科櫻桃屬植物杏的干燥成熟種子，苦杏仁的功效主要是止咳平喘和潤(rùn)腸通便，其藥物的主要有效成分為苦杏仁苷和苦杏仁油，除了這些主要的有效藥物成分以外，苦杏仁還有多種成分，諸如苦杏仁酶、多種氨基酸類營(yíng)養(yǎng)成分、揮發(fā)性成分和微量元素等。目前苦杏仁苷含量的測(cè)定方法繁多，采用滴定法間接測(cè)定苦杏仁苷含量的可見于中國(guó)藥典中的相關(guān)記載;隨著現(xiàn)代科技的發(fā)達(dá)以及中藥研究的深入，有學(xué)者采用高效液相色譜法、薄層掃描法、應(yīng)用紫外吸收光譜法、化學(xué)發(fā)光法、指紋圖譜等測(cè)定苦杏仁苷的含量[9-12]。本研究基于指紋圖譜對(duì)苦杏仁中的有效成分苦杏仁苷進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，麻黃湯不同配伍方式中對(duì)苦杏仁有效成分苦杏仁苷每劑含量未見明顯差異，進(jìn)行方差分析后結(jié)果顯示，麻黃湯不同配伍中麻黃、桂枝、甘草對(duì)苦杏仁苷的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。有研究顯示[13-14]麻黃湯全方配伍對(duì)苦杏仁中的苦杏仁苷有效含量沒有影響，只有麻黃與苦杏仁配伍時(shí)，其水煎液中苦杏仁苷含量亦未見增加，與本研究結(jié)果一致。

甘草為豆科植物、脹果甘草、光果甘草的干燥根及根莖，是中藥方劑中最常用的藥物之一，其功效以補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥為主，其中也因?yàn)檎{(diào)和諸藥這一功效而應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理研究證明，甘草中含有甘草酸、黃酮類和生物堿類化合物等，多種化合物各司其職發(fā)揮抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能等功效。目前對(duì)甘草的用藥評(píng)價(jià)主要以其有效成分之一甘草酸的含量（定量指標(biāo)），作為評(píng)價(jià)甘草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一[15-16]。目前隨著科技的發(fā)達(dá)，甘草酸的測(cè)定方法有很多，其中以高效液相色譜法最為多見，其次毛細(xì)管電泳法和薄層掃描法等[17-18]。本研究基于指紋圖譜研究，結(jié)果顯示麻黃湯不同配伍方式中以H1單純甘草中甘草酸含量為最高，而麻黃湯全方A1中的甘草酸含量為最低;不同配伍中麻黃、桂枝和苦杏仁均降低麻黃湯中甘草酸的含量。由此推測(cè)可能甘草的有效成分甘草酸與麻黃湯中的其他三味藥材發(fā)生劇烈的化學(xué)反應(yīng)，無論是有效成分之間的還是藥物毒性之間的，這些反應(yīng)降低了甘草有效成分在不同麻黃湯配伍方式中甘草酸的含量，幫助甘草在麻黃湯中行使調(diào)和諸藥的功能。

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