唐艷 武曉曉 鄧崇嶺 劉冰浩 陳傳武 牛英

摘 要： 該研究以沙柑（Citrus nobilis）以及其他的柑橘類(lèi)共22個(gè)品種的花粉為材料，通過(guò)FEI Quanta 200場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡觀察花粉的赤道面、極面、外壁紋飾等形態(tài)特征，并對(duì)沙柑的分類(lèi)地位及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：沙柑花粉為中等型、形狀為長(zhǎng)球形，存在4條孔溝，極軸長(zhǎng)為（29.98 ± 1.18） μm，赤道軸長(zhǎng)為（22.32 ± 1.03） μm；外壁紋飾為網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼為圓形或者近圓形，網(wǎng)眼直徑大小為（0.89 ± 0.10） μm，網(wǎng)脊平寬光滑不隆起，網(wǎng)脊寬度為（0.62 ± 0.07） μm。經(jīng)過(guò)花粉形態(tài)比較并進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示沙柑應(yīng)為雜種起源，且與扁柑、年橘、廣西紅皮酸橘的花粉特征較為接近，在遺傳距離0.442處聚為一組，推測(cè)四者具有一定的親緣關(guān)系，且沙柑與后三者相比可能較為原始；沙柑與岑溪酸橘、印度酸橘、姑婆山野生元橘、賀州野橘等可能存在一定的親緣關(guān)系但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可結(jié)合分子標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行更深層次的研究。該研究結(jié)果為沙柑遺傳演化、分類(lèi)地位以及親緣關(guān)系的鑒定提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 沙柑， 花粉， 形態(tài)， 親緣關(guān)系， 演化

中圖分類(lèi)號(hào)： Q944.58

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2018）02-0250-10

Preliminary observation on pollen morphology of Shagan （Citrus nobilis）

TANG Yan1， WU Xiaoxiao1，2， DENG Chongling1*， LIU Binghao1， CHEN Chuanwu1， NIU Ying1

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology， Guangxi Academy of Specialty Crops， Guilin 541004， Guangxi， China； 2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004， Guangxi， China ）

Abstract： Pollen morphology has a certain conservatism， so it is often used as a classification basis for plant resources. The observation of citrus pollen morphology can provide some references for citrus classification. The pollen of Shagan（Citrus nobilis） and other citrus material was observed by FEI Quanta 200 field emission scanning electron microscopy. The morphological characteristics of pollen equatorial view， polar view and exine ornamentation were analyzed by the SPSS and NTsys software. And their genetic relationship was analyzed. The results showed that the pollen of C. nobilis is 4-colpate type and it had round or roughly round pollen mesh. The pollen of equatorial axis of C. nobilis was （29.98 ± 1.18） μm， the polar axis was （22.32 ± 1.03） μm， the mesh ridge was （0.62 ± 0.07） μm； and the mesh size was （0.89 ± 0.10） μm. The pollen morphology was compared with the results of cluster analysis. The results showed that the C. nobilis should be the origin of hybrids. The pollen characteristics of Biangan， Nianju， Guangxihongpisuanju and C. nobilis were similar， and the genetic distance was 0.442， which suggested that the four had a certain genetic relationship， and C. nobilis may be more primitive. There are some phylogenetic relationships in the world， such as Cenxisuanju， Yindusuanju， Guposhanyeshengyuanju and Hezhouyeju， which can be further studied with molecular markers. This study provides information for genetic evolution， taxonomic status and relative relationship of C. nobilis.

Key words： Shagan（Citrus nobilis）， pollen， morphology， relative relationships， evolution

沙柑，別名廣西沙柑、大沙柑、柑宏（“大柑”的意思），原產(chǎn)中國(guó)廣西及越南。在中國(guó)主要分布于廣西都安、邕安、上思、靖西、宜山等市縣，栽培歷史較長(zhǎng)，是廣西西南部的地方品種。沙柑在柑橘分類(lèi)學(xué)上地位顯著，通常作為蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantioideae）柑橘族（Citreae）柑橘亞族（Citrinae）柑橘屬（Citrus L.）真正柑橘亞屬（subgenus Eucitrus）寬皮柑橘區(qū)（C. reticulata Blanco）柑亞區(qū)（Mandarin）中代表種之一。曾勉（1960）提出的柑橘分類(lèi)系統(tǒng)中將沙柑[（S. Nobilis （Lauriro） Tseng]定為一個(gè)種，并認(rèn)為可能是雜交種；Singh & Nath（1970）在第一屆國(guó)際柑橘會(huì)議上提出《實(shí)用柑橘分類(lèi)的方法》將王柑（Citrus nobilis）定為一個(gè)種；蔣聰強(qiáng)（1983）提出的“柑桔三屬左右線(xiàn)分類(lèi)系統(tǒng)”也將沙柑（Citrus nobilis Lour）定為一個(gè)種；《中國(guó)果樹(shù)志·柑橘卷》在柑亞區(qū)記錄有3個(gè)種，分別是莽山野柑（Citrus mangshanensis）、沙柑（C. nobilis）、黃柑（C. speciosa），并認(rèn)為沙柑與王柑、黃巖本地廣橘、日本九年母應(yīng)同屬一個(gè)種（周開(kāi)隆和葉蔭民，2010）。中外柑橘學(xué)術(shù)界普遍將沙柑劃分柑亞類(lèi)，并推測(cè)沙柑為雜交種（梁國(guó)魯和陳全有，1994）。沙柑的來(lái)源不詳，目前也未發(fā)現(xiàn)野生分布，因此有必要對(duì)沙柑進(jìn)行孢粉學(xué)、分子標(biāo)記及基因組學(xué)等的研究，以明確沙柑的起源、演化途徑及分類(lèi)學(xué)地位。

花粉是一個(gè)極其微小、精致的細(xì)胞，它的全部性狀包含著豐富的生命信息和科學(xué)信息，引起植物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、植物分類(lèi)學(xué)、植物系統(tǒng)學(xué)、古植物學(xué)、植物地理學(xué)等多學(xué)科關(guān)注，給了人們極大的空間去進(jìn)一步了解和探索，同時(shí)孢粉學(xué)的知識(shí)又成為上述多學(xué)科發(fā)展理論與應(yīng)用研究的基礎(chǔ)（李天慶等，2011）。植物花粉有其獨(dú)特的外形、復(fù)雜的外壁結(jié)構(gòu)和精細(xì)的紋飾，并且在遺傳中具有相對(duì)較強(qiáng)的保守性和穩(wěn)定性，這對(duì)植物種和品種的鑒定具有重要的意義（王偉銘，2009；武曉曉等，2017）?；诖?，本研究利用花粉形態(tài)特征對(duì)沙柑進(jìn)行分析，為其遺傳演化、分類(lèi)地位以及親緣關(guān)系的鑒定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本研究所用的沙柑和部分試驗(yàn)材料的花粉采自廣西特色作物研究院資源圃，其余材料的花粉采自中國(guó)農(nóng)科院柑桔研究所（重慶）、湖南省園藝研究所（長(zhǎng)沙），共計(jì)22份材料（表1）。

于盛花期選擇健壯植株，采集樹(shù)冠外圍中上部含苞待放的花蕾，用消過(guò)毒的鑷子去掉花瓣和花萼，只留花藥，置于烘箱內(nèi)37 ℃烘24 h以上，將獲得的花粉放置于干燥管中低溫保存。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及測(cè)定方法

1.2.1 花粉電鏡掃描觀察 用牙簽挑取少量花粉，均勻的撒在粘有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，用離子濺射儀進(jìn)行真空噴金鍍膜，置于FEI Quanta 200場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡下進(jìn)行觀察，工作電壓為5 kV，選擇有代表性的清晰視野進(jìn)行觀察，并拍照保存，800倍觀察花粉的整體效果，6 000倍觀察花粉的極面和赤道面，24 000倍觀察花粉的外壁紋飾特征， 并測(cè)量極軸長(zhǎng)（P）、赤道軸長(zhǎng)（E）、網(wǎng)脊寬度以及網(wǎng)眼直徑的大小。

1.2.2 花粉定量特征的測(cè)量及統(tǒng)計(jì) 每份試驗(yàn)材料隨機(jī)選取20?；ǚ哿＿M(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的測(cè)量和統(tǒng)計(jì)，用SPSS軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選取赤道軸長(zhǎng)、極軸長(zhǎng)、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)脊寬度共4個(gè)定量特征，用NTsys-pc軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類(lèi)，聚類(lèi)單元之間的遺傳距離以平均分類(lèi)距離計(jì)算，聚類(lèi)圖選用UPGMA法（陳鵬等，2016）。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉的外形大小

沙柑花粉以單粒形式存在，中等大小，花粉粒形狀為長(zhǎng)球形，極軸長(zhǎng)度為（29.98 ± 1.18） μm，赤道軸長(zhǎng)度為（22.32 ± 1.03） μm，P/E均值為1.34（表1）?；ǚ哿＞哂?條孔溝，極面觀為四裂圓形，赤道面觀為長(zhǎng)圓形（圖2）。

2.2 花粉的外壁紋飾

沙柑外壁紋飾為網(wǎng)狀紋飾，即由凸起的網(wǎng)脊和網(wǎng)眼組成，網(wǎng)眼和保衛(wèi)網(wǎng)眼的一半網(wǎng)脊形成一個(gè)網(wǎng)胞。經(jīng)比較觀察，沙柑網(wǎng)眼中等大小，形狀為圓形或近圓形，網(wǎng)眼直徑為（0.89±0.10） μm，網(wǎng)脊平寬光滑且不隆起，寬度為（0.62±0.07） μm。其具體特征見(jiàn)圖1至圖5。

2.3 聚類(lèi)結(jié)果分析

利用NTsys軟件對(duì)花粉的表型形狀進(jìn)行了聚類(lèi)樹(shù)分析，在遺傳距離1.06處，將試驗(yàn)材料分為7個(gè)組群（圖6）。

第一組包括1，即羅浮金柑，主要特點(diǎn)為花粉粒較小，單獨(dú)聚為一類(lèi)；第二組包括2、21，即23號(hào)枳和廣佛手；第三組為18，即沙田柚，單獨(dú)為一類(lèi)；第四組包括3、4，即金刀峽宜昌橙和紅河大翼橙，花粉粒特征為網(wǎng)脊較窄；第五組包括7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、19、20、22共13個(gè)品種，主要為柑類(lèi)、橘類(lèi)和檸檬枸櫞類(lèi)，該類(lèi)主要特征是花粉粒稍大，網(wǎng)眼直徑比網(wǎng)脊寬度要稍大；第六組10，即道縣野橘，花粉粒中等大、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)脊寬為中等，單獨(dú)聚為一類(lèi)；第七組包括5、6，即莽山野柑和姑婆山野生皺皮柑，主要特點(diǎn)為網(wǎng)眼較大，網(wǎng)脊較狹并且突出，兩者單獨(dú)聚為一類(lèi)。

3 討論與結(jié)論

本研究中，沙柑花粉粒大小、形狀及外壁紋飾與扁柑、年橘、廣西紅皮酸橘相近，推測(cè)沙柑與后三者可能存在一定的親緣關(guān)系，特別是沙柑與扁柑可能存在較近的親緣關(guān)系。這與劉通等（2016）利用SSR和SRAP分子標(biāo)記的結(jié)果一致。劉通等（2016）聚類(lèi)結(jié)果顯示在遺傳距離0.802處沙柑與岑溪酸橘、賀州野橘等聚為一組，表明存在一定的親緣關(guān)系；郭麗英等（2011）對(duì)扁柑種質(zhì)資源親緣關(guān)系進(jìn)行ISSR分析，認(rèn)為扁柑在分類(lèi)地位上屬于橘類(lèi)。本研究中，扁柑先與年橘聚為一組然后與沙柑聚為一組，沙柑又與多個(gè)柑橘品種在不同的遺傳距離處聚類(lèi)為組，因此推測(cè)沙柑應(yīng)為雜種起源。這與曾勉（1960）對(duì)柑橘分類(lèi)的結(jié)果一致。本研究中，沙柑在遺傳距離0.476處與賀州野橘、岑溪酸橘、印度酸橘等聚為一組，與劉通等（2016）的研究結(jié)果一致；劉冰浩等（2015）對(duì)廣西地方柑橘資源ISSR分析分子標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果顯示，沙柑與南豐蜜橘聚為一組繼而又與廣西紅皮酸橘聚為一組。本研究中，在遺傳距離0.442處沙柑與廣西紅皮酸橘聚為一組，推測(cè)沙柑與廣西紅皮酸橘可能存在一定的親緣關(guān)系。這與劉冰浩等（2015）的研究結(jié)果一致。

柑橘花粉形態(tài)進(jìn)化途徑通常為較原始的柑橘花粉均為大型、網(wǎng)眼大、網(wǎng)脊比較窄；較進(jìn)化的柑橘花粉為小型、網(wǎng)眼小、網(wǎng)脊較寬（葉蔭民等，1982；劉庚峰等，1992；方從兵，2002；李天慶等，2011）。由花粉形態(tài)特征可以推測(cè)，沙柑比扁柑、年橘、廣西紅皮酸橘較原始。但是，沙柑的花粉粒為中等型，網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)脊寬度在所有試驗(yàn)材料中都處于中等大小，因此推測(cè)，沙柑是較莽山野柑（劉庚峰等，1990）、姑婆山野生皺皮柑，姑婆山野生元橘等野生柑橘類(lèi)型更進(jìn)化的寬皮柑橘類(lèi)型。由此推測(cè)寬皮柑橘的演化路徑為莽山野柑、姑婆山野生皺皮柑→姑婆山野生元橘、賀州野橘、岑溪酸橘、印度酸橘→沙柑、扁柑、年橘→道縣野橘→立花橘、沙糖橘，其中道縣野橘演化成為一獨(dú)特的種類(lèi)。

柑橘大多數(shù)種是無(wú)融合生殖的，根據(jù)花粉對(duì)柑橘進(jìn)行分類(lèi)具有更重要的意義，花粉大小、網(wǎng)眼大小、網(wǎng)脊?fàn)顩r是區(qū)分柑橘分類(lèi)群的重要特征（周開(kāi)隆和葉蔭民，2010）?；ǚ鄄灰纂S外界環(huán)境的變化而發(fā)生變異，難以被高溫高壓所破壞，很耐酸堿，同一植物的花粉，不論是現(xiàn)代還是古代的，其形態(tài)特征是相同的（韋仲新，2003）。本研究中，花粉外壁紋飾特征受外界條件影響也不大，但花粉的形狀和大小受試驗(yàn)條件的影響較大，經(jīng)醋酸酐分解法處理的花粉較大，極軸較短而赤道軸較長(zhǎng)，不經(jīng)處理的花粉花粉較長(zhǎng)，極軸較長(zhǎng)而赤道軸較短。因此，花粉形態(tài)特征對(duì)柑橘的分類(lèi)以及親緣關(guān)系的鑒定可以提供一定的依據(jù)，但需進(jìn)一步結(jié)合解剖學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、生物進(jìn)化等方面進(jìn)行更加深入的研究。

本研究通過(guò)花粉形態(tài)的特征對(duì)沙柑進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示沙柑花粉粒為中等大小，4條孔溝，具有網(wǎng)狀紋飾且網(wǎng)眼為圓形或近圓形、網(wǎng)脊平寬光滑且不隆起，與大部分寬皮柑橘的花粉形態(tài)特征相似。聚類(lèi)結(jié)果表明沙柑可能與扁柑、年橘、廣西紅皮酸橘的親緣關(guān)系較近，與賀州野橘、岑溪酸橘、印度酸橘、姑婆山野生元橘等親緣關(guān)系次之，與立花橘、沙糖橘、枸櫞、檸檬、橙類(lèi)有一定的親緣關(guān)系但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此認(rèn)為沙柑應(yīng)為雜種起源。本研究結(jié)果可以為沙柑的遺傳演化、分類(lèi)地位以及親緣關(guān)系的鑒定提供一定的參考依據(jù)。

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