申茂磊 高存祥 鄭麗英 王勤章 徐浩 郝志強 傅家豪 錢彪

中圖分類號 R361+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2607-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.04

摘 要 目的：研究四環(huán)素對納米細(xì)菌（NB）感染的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2中鈣敏感受體（CaSR）、緊密連接蛋白14（Claudin-14）表達(dá)的影響，為抑制腎結(jié)石的形成提供參考。方法：將HK-2細(xì)胞分為空白對照組、NB組和四環(huán)素組（NB+四環(huán)素），每組3個復(fù)孔，各組分別加入相應(yīng)NB和藥物后共培養(yǎng)24 h。采用透射電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化，運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和Western blot法分別檢測細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對照組比較，NB組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，胞核裸露在外，微絨毛基本消失，線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；四環(huán)素組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失，部分線粒體結(jié)構(gòu)腫脹不明顯，細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。與NB組比較，四環(huán)素組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：NB可能通過上調(diào)HK-2細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表達(dá)促進(jìn)腎結(jié)石的形成，而四環(huán)素可能通過作用于NB降低CaSR、Claudin-14 mRNA和蛋白的表達(dá)抑制腎結(jié)石的形成。

關(guān)鍵詞 四環(huán)素；納米細(xì)菌；人腎小管上皮細(xì)胞HK-2；鈣敏感受體；緊密連接蛋白14

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of tetracycline on the expression of calcium-sensing receptor （CaSR） and Claudin-14 in nanobacteria-infected （NB） human renal tubular epithelial cells HK-2， and to provide reference for inhibiting the formation of kidney stone. METHODS： HK-2 cells were divided into blank control group， NB group and tetracycline group （NB+tetracycline）， with 3 complex holes in each group. They were given relevant nanobacteria and drug for 24 h. Morphology and ultrastructural changes of cells were observed by TEM. mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were measured by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） and Western blot assay. RESULTS： Compared with blank control group， the damaged structure of cell membrane， exposed nucleus， disappeared microvilli， small number of mitochondria and swollen structure were found in NB group； mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were increased significantly （P<0.05）. The complete structure of cell membrane， disordered structure of microvilli， disappeared local villi and not obvious swollen of some mitochondrial structure were found in tetracycline group； mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were increased significantly （P<0.05）. Compared with NB group， mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 were decreased significantly in tetracycline group （P<0.05）. CONCLUSIONS： NB may improve the formation of kidney stones by up-regulating the mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 in HK-2 cells， while tetracycline may reduce the mRNA and protein expression of CaSR and Claudin-14 by anti-NB effect so as to inhibit kidney stone formation.

KEYWORDS Tetracycline； Nanobacteria； Human renal tubular epithelial cells HK-2； CaSR； Claudin-14

腎結(jié)石是泌尿外科疾病之一[1]，該病的成因非常復(fù)雜，納米細(xì)菌（Nanobacteria，NB）感染被認(rèn)為是導(dǎo)致結(jié)石形成的主要原因之一[2]，有文獻(xiàn)報道，90%以上腎結(jié)石患者的血液、尿液和結(jié)石中可以檢測出NB感染[3]。國外學(xué)者通過觀察研究發(fā)現(xiàn)，NB是一種具有超微結(jié)構(gòu)的人體病原菌，可以黏附并損害腎小管上皮細(xì)胞，其菌體外周的羥磷灰石結(jié)晶外殼可以不斷富集尿液中鈣離子，與壞死細(xì)胞碎片共同參與形成結(jié)石[4]；還有研究顯示，多數(shù)腎結(jié)石患者合并有尿鈣重吸收障礙[5]，其高鈣濃度尿液可以促進(jìn)含鈣結(jié)石的形成[6]，這些都提示NB引起的結(jié)石可能是含鈣結(jié)石。有研究表明，鈣敏感受體（Calcium-sensing receptor， CaSR）可以通過影響緊密連接蛋白-14（Claudin-14）的表達(dá)，引起尿液中鈣離子濃度發(fā)生變化，導(dǎo)致高尿鈣腎結(jié)石的形成[7]。然而由于NB的自我礦化特性，以至于眾多的抗生素都對其無效，但是四環(huán)素能沉積在NB鈣化的外殼上并穿透外殼發(fā)揮抗菌作用[8]，是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，如有研究者通過研究口服四環(huán)素片治療NB所致Ⅲ型前列腺炎發(fā)現(xiàn)，83.3%的患者癥狀得到改善，表明四環(huán)素可能通過抗NB治療慢性前列腺炎[9]。但是四環(huán)素能否通過抗NB治療影響人腎小管上皮細(xì)胞HK-2中CaSR、Claudin-14的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防以及治療NB所致腎結(jié)石的目的，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)石的診斷和治療都有了長足的進(jìn)步，但傳統(tǒng)的體外碎石治療后患者的5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)41.8%[10]。因此，探究泌尿系結(jié)石的形成機制以尋找新的治療手段是當(dāng)前臨床中亟待解決的難題。

本課題旨在通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測NB對CaSR、Claudin-14基因和蛋白表達(dá)的影響，探討四環(huán)素對NB感染的HK-2細(xì)胞中CaSR、Claudin-14表達(dá)的影響，為泌尿系結(jié)石的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

CFX96 qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國 Bio-Tek公司）；JSM-6390LV透射電子顯微鏡（日本電氣株式會社）。

1.2 藥品與試劑

四環(huán)素（北京索萊寶科技有限公司，批號：IT0130，純度：>95%）；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：10569010、22400071）；磷酸鹽緩沖液（PBS）和胎牛血清（美國Hyclong公司，批號：SH30256.01、SH30084.03）；兔抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體、兔抗Claudin-14抗體、小鼠抗CaSR抗體（美國Abcam公司，批號：ab8227、ab19035、ab19347）；抗兔辣根過氧化物酶、抗小鼠辣根過氧化物酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（北京中衫金橋有限公司，批號：2B-2301、2B-2305、TA-08）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0009）；化學(xué)發(fā)光（ECL）液（德國Merck-Millipore公司，批號：WBULS0100）；Trizol試劑（美國Life-Invitrogen公司，批號：15596026）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司，批號：RR037A、RR820L）；引物均由上海生工生物公司設(shè)計合成；其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

2 方法

2.1 NB的培養(yǎng)

參照褚浩等[11]的方法進(jìn)行操作。收集新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科臨床確診腎結(jié)石且未應(yīng)用藥物或手術(shù)治療患者的尿液，將尿液依次經(jīng)過0.45、0.22 μm一次性正壓濾器過濾，加入高糖培養(yǎng)基后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期。

2.2 分組與給藥

選取HK-2細(xì)胞，隨機分為3組，分別為空白對照組、NB組和四環(huán)素組?？瞻讓φ战M只加入胎牛血清和1640培養(yǎng)液；NB組加入2 mL的提前配制好的含NB菌液的培養(yǎng)基[650 nm波長的光密度（OD650 nm）為0.7]；四環(huán)素組加入用培養(yǎng)基提前配制好的含四環(huán)素和NB的培養(yǎng)基（四環(huán)素5 mg/L，NB的OD650 nm為0.7）。

2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察

取HK-2細(xì)胞接種于6孔板上，每孔約4×106個細(xì)胞，按“2.2”項下加入相應(yīng)培養(yǎng)基和藥物，共培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將提取好的懸液12 000 r/min離心后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，用PBS浸泡10 min后棄上清；用預(yù)冷的3%戊二醛固定2 h，PBS洗2次，每次3 min；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS緩沖液洗2次，每次同樣洗3 min；梯度乙醇脫水，包埋后在80 ℃恒溫條件下聚合過夜，最后進(jìn)行超薄切片、負(fù)染色，于透射電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化。

2.4 qRT-PCR檢測細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表達(dá)

將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約4×106個細(xì)胞，按“2.2”項下加入相應(yīng)培養(yǎng)基和藥物，每組3個復(fù)孔，共培養(yǎng)24 h后應(yīng)用Trizol提取總RNA，為防止RNA降解，全程操作在冰上進(jìn)行，然后測定所提取RNA純度與濃度，將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行CaSR、Claudin-14和β-actin mRNA的PCR檢測。反應(yīng)條件按照試劑盒說明書設(shè)定。以β-actin為內(nèi)參，計算各組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列與片段長度見表1。

2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中CaSR、Claudin-14蛋白表達(dá)

將HK-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，按“2.2”項下加入相應(yīng)培養(yǎng)基和藥物，共培養(yǎng)24 h，用PBS緩沖液潤洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，冰浴30 min后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量。各組取40 μg蛋白，10%丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，于小鼠抗CaSR抗體（稀釋比例1 ∶ 500）和兔抗Claudin-14抗體（稀釋比例 1 ∶ 500）中4 ℃下孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗4次，每次5 min，再分別加入抗小鼠辣根過氧化物酶和抗兔辣根過氧化物酶（稀釋比例1 ∶ 10 000），室溫孵育2 h，用TBST緩沖液漂洗4次，每次5 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，曝光X光膠片，獲取的結(jié)果通過Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，計算CaSR、Claudin-14的相對表達(dá)量。試驗重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)

空白對照組HK-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整正常，膜外微絨毛數(shù)量豐富、排列規(guī)則，雙層核膜結(jié)構(gòu)正常，核周隙正常，線粒體形態(tài)正常，線粒體脊排列規(guī)則有序，未見腫脹或萎縮。NB組HK-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，胞核裸露在外，微絨毛基本消失，線粒體數(shù)量較少、結(jié)構(gòu)腫脹。四環(huán)素組HK-2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失，部分線粒體結(jié)構(gòu)腫脹不明顯。各組細(xì)胞的透射電子顯微鏡圖見圖1。

3.2 細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表達(dá)水平

與空白對照組比較，NB組和四環(huán)素組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與NB組比較，四環(huán)素組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14 mRNA的相對表達(dá)量見圖2。

3.3 細(xì)胞中CaSR、Claudin-14蛋白表達(dá)結(jié)果

與空白對照組比較，NB組和四環(huán)素組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14蛋白的表達(dá)水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與NB組比較，四環(huán)素組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各組細(xì)胞中CaSR、Claudin-14蛋白的電泳圖見圖3，相對表達(dá)量見圖4。

4 討論

泌尿系統(tǒng)結(jié)石的病因非常復(fù)雜，其涉及到多種因素如藥物副反應(yīng)、遺傳易感性等[12-13]。近年來，有文獻(xiàn)報道NB在腎結(jié)石形成過程中起關(guān)鍵性的作用[5]。NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，與體內(nèi)多種病理性鈣化過程密切相關(guān)[14]。Garcia CE等[15]以NB建立大鼠腎結(jié)石模型，解剖發(fā)現(xiàn)大鼠腎小管廣泛鈣化，提出NB是形成結(jié)石的主要原因。賈宏偉等[16]通過大鼠尾靜脈注射NB，8周后發(fā)現(xiàn)大鼠遠(yuǎn)曲小管和近曲小管管腔出現(xiàn)不規(guī)則結(jié)晶體。Xin H等[17]從腎結(jié)石患者血液中提取NB，并與人腎小管上皮細(xì)胞HK-2共培養(yǎng)，建立體外模型，發(fā)現(xiàn)NB通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對HK-2細(xì)胞造成損傷。本課題組前期通過大鼠尾靜脈注射NB，同樣發(fā)現(xiàn)腎臟組織中有結(jié)晶顆粒出現(xiàn)[11]。

CaSR是一種與鈣代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)血漿細(xì)胞膜受體[18]。有研究證明，腎小管通過CaSR、Claudin-14通路調(diào)控鈣的代謝，對于Claudin-14基因敲除的大鼠，CaSR失去了對鈣離子代謝的調(diào)控作用[19]。本研究通過從確診的腎結(jié)石患者尿液中培養(yǎng)NB，然后與HK-2細(xì)胞共同培養(yǎng)，于24 h后檢測各組細(xì)胞中CaSR和Claudin-14的mRNA和蛋白表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示，NB組中的CaSR和Claudin-14無論在mRNA水平還是蛋白水平均高于空白對照組，表明NB可能是通過上調(diào)CaSR和Claudin-14的表達(dá)，導(dǎo)致尿液中鈣離子濃度發(fā)生變化而促進(jìn)高尿鈣腎結(jié)石形成[7，20]。

四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，其可以穿透NB的鈣質(zhì)外殼從而發(fā)揮抗菌作用。有多篇研究報道，四環(huán)素在治療NB相關(guān)的慢性前列腺炎等方面均取得了不錯的效果[9，21]。Hu WG等[3]通過尾靜脈注射NB建立大鼠腎結(jié)石模型，發(fā)現(xiàn)灌服四環(huán)素可減少大鼠24 h尿乳酸脫氫酶以及腎小管結(jié)晶數(shù)，推測四環(huán)素可能有抑制腎結(jié)石形成的作用。但是四環(huán)素能否通過抗NB對腎小管上皮細(xì)胞HK-2中CaSR和Claudin-14的表達(dá)產(chǎn)生影響，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，與四環(huán)素、NB共培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞中CaSR和Claudin-14的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯低于NB組，表明四環(huán)素可能通過抑制NB降低HK-2細(xì)胞中CaSR和Claudin-14的表達(dá)影響腎結(jié)石的形成，這一結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了四環(huán)素在腎結(jié)石的預(yù)防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，本研究初步證實NB可能通過以下途徑導(dǎo)致腎結(jié)石：NB感染HK-2細(xì)胞后上調(diào)CaSR、Claudin-14表達(dá)，導(dǎo)致高鈣尿，促進(jìn)鈣離子向NB的富集，進(jìn)而形成結(jié)石；而四環(huán)素又可以抑制這一過程。本課題組后期將進(jìn)一步驗證不同濃度的四環(huán)素對NB感染HK-2細(xì)胞中CaSR、Claudin-14的抑制作用，以期證實四環(huán)素殺滅NB可能是預(yù)防和治療結(jié)石的一個新的方向。

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（收稿日期：2018-04-24 修回日期：2018-07-16）

（編輯：鄒麗娟）