余淵 程杰

摘要 目的：探討分析玉米須總皂苷（Saponin Extracted from Zea Mays L，ZMLS）對高脂飲食加鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠脂代謝的影響，以為臨床中本病的治療提供理論基礎(chǔ)。方法：60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組，2型糖尿病組以及玉米須總皂苷觀察組，每組20只，2型糖尿病模型建立成功后，玉米須總皂苷觀察組給予玉米須總皂苷4 mg/（kg·d）灌胃治療，正常組和2型糖尿病組給生理鹽水灌胃比較，治療4周和8周后處死大鼠各半，HE染色檢測肝臟脂肪蓄積特點(diǎn)，試劑盒檢測血脂和抗氧化指標(biāo)，RT-PCR和Western Blot檢測肝臟TNF-α和IL-6表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果：HE染色可見，與正常組比較，模型組有明顯脂肪空泡，提示2型糖尿病大鼠有明顯的肝臟脂肪代謝異常，玉米須總皂苷治療后，其脂肪空泡明顯減少；與正常組比較，模型組血糖、血脂TG、氧化因子MDA明顯升高（P<0.05），胰島素、血脂HDL-C和抗氧化指標(biāo)SOD明顯下降（P<0.05），玉米須總皂苷治療4周后，TG和MDA明顯下降（P<0.05），HDL-C和SOD明顯升高（P<0.05），治療8周后進(jìn)一步改善（P<0.05）；RT-PCR和Western Blot可見與正常組比較，模型組TNF-α和IL-6表達(dá)明顯升高（P<0.05），治療4周后有一定降低，但改善并不明顯，治療8周后均明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：玉米須總皂苷對2型糖尿病大鼠脂代謝具有明顯的調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制可能與其可調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 玉米須總皂苷；腫瘤壞死因子-α；白介素-6；2型糖尿病；大鼠

Abstract Objective：To study the effects of Zea mays L.saponin （ZMLS） on type 2 diabetes rats induced by high fat diet and Streptozocin （STZ），which provided a fundamental basis for the treatment of the disease.Methods：A total of 60 male SD rats were randomly divided into normal group，type 2 diabetes group （model groups），and ZMLS group，with 20 cases in each group.Rats in ZMLS group were given ZMLS 4 mg/kg/day by gavage treatment，rats in normal group and model group were given physiological saline by gavage.After treatment for 4 weeks and 8 weeks，half of the rats were sacrificed，HE staining was used to detect the Liver fat accumulation characteristics，and lipid and antioxidant indexes were detected by the kit.The expression of TNF-α and IL-6 in liver tissue were detected by RT-PCR and Western Blot.Results：HE staining showed that there were obvious fat vacuoles in the model group compared with the normal group，which showed an obvious abnormality of liver fat metabolism in type 2 diabetes rats.After treatment，the fat vacuoles decreased significantly.Compared with the normal group，the blood sugar，TG and MDA in the model group were significantly increased （P<0.05）； insulin，HDL-C and SOD were decreased （P<0.05）.After 4 weeks of ZMLS treatment，the levels of TG and MDA were significantly decreased （P<0.05） and the levels of insulin，HDL-C and SOD were significantly increased （P<0.05），which further improved after 8 weeks of treatment （P<0.05）； Compared with the normal group by RT-PCR and Western Blot，the expression of TNF-α and IL-6 in the model group was significantly increased （P<0.05） and then decreased after 4 weeks treatment，but the improvement was not obvious.After 8 weeks of treatment，all the indexes significantly reduced （P<0.05）.Conclusion：ZMLS can significantly regulate blood lipid of rats with type 2 diabetes，which maybe related with its regulating function of the expression of TNF-α and IL-6.

Key Words Zea mays L.saponin （ZMLS）； Tumor Necrosis Factor-α； InterLeukin-6； Type 2 Diabetes； Rat

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.042

當(dāng)前2型糖尿病是最為流行的一種糖代謝疾病，近年來隨著人們生活水平的提高，本病發(fā)病率逐年升高。最新研究顯示，目前我國2型糖尿病患者高達(dá)1億人，已經(jīng)成為威脅人們健康的一大疾病[1-2]。本病初期癥狀不典型，多通過體檢發(fā)現(xiàn)，因此容易被人們忽視，而一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)已經(jīng)成為中晚期糖尿病，因此關(guān)注和研究本病具有十分重要的意義[3-4]。玉米須總皂苷是從玉米須中提取的一類皂苷類化合物，關(guān)于玉米須或玉米須總皂苷等對2型糖尿病的作用目前已有文獻(xiàn)報道[5-6]，但是關(guān)于其對2型糖尿病脂代謝的影響還沒有研究報道，因此本次研究著眼于此，采用高脂飲食+STZ建立2型糖尿病大鼠模型，觀察玉米須總皂苷是否有降脂作用，以及其是否對肝臟腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白介素-6（InterLeukin-6，IL-6）是否有改善作用，以為臨床本藥的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD（Sprague Dawley）雄性大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量為180～220 g，所有大鼠均購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠合格證號為：SCXK（鄂）2011-0007。大鼠飼養(yǎng)和造模用基礎(chǔ)飼料、高脂飼料和飼養(yǎng)用墊料均購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，基礎(chǔ)飼料配方為：碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、粗纖維4.6%、脂肪3.4%、其他10.0%；高脂飼料為：基礎(chǔ)飼料66.5%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%。

1.1.2 藥物 玉米須總皂苷由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供（純度98%）。

1.1.3 試劑與儀器 血糖、胰島素、丙二醛（MDA）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，SOD試劑盒購物武漢博爾德生物公司；戊巴比妥鈉，TNF-α和IL-6多克隆抗體、單克隆抗體b-actin購于美國Santa Cruz公司、抗體稀釋液、二抗、PV-6002和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，多聚甲醛購于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。顯微鏡（日本Olympus光學(xué)公司）。LEICA RM 2025型病理組織切片機(jī)（德國Leica公司）。PHY-H型病理組織漂烘處理儀（常州市中威電子儀器有限公司）。HH.W21.Cu600型電熱恒溫水浴箱（上海市百典儀器廠）、FA2104型電子天平（上海右一儀器有限公司）。紫外可見分光光度計（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）。AMR-100型酶標(biāo)儀（杭州奧盛生物公司）。Bio-rad蛋白電泳儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）。Applied Biosystems pcr儀（賽默飛世爾中國）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備造模方法 60只大鼠在購買后均要求適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，之后按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組，模型組，以及玉米須總皂苷觀察組，每組分別為20只，10 d后模型組和玉米須總皂苷觀察組給予高脂高糖飲食4周+一次性STZ注射建立2型糖尿病大鼠模型，2型糖尿病大鼠模型的建立標(biāo)準(zhǔn)為血糖檢測連續(xù)7 d均>15.6 mmol/L。

1.2.2 干預(yù)方法 模型建立成功后玉米須總皂苷觀察組給予玉米須總皂苷4 mg/kg·d灌胃治療，正常組和模型組只給予生理鹽水灌胃治療，分別于治療4周后和8周后處死大鼠各半進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 肝臟組織和血液的收集 使用3%戊巴比妥鈉3 mL腹腔注射麻醉大鼠，大鼠麻醉后將其固定于解剖臺，之后立即沿腹中線切開腹腔，掏出肝臟，最后統(tǒng)一取肝左葉置于4%中性福爾馬林溶液中固定，其余置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。完成上述后，小心剖開胸腔，用10 mL注射器沿腹中線取血，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心15 min后，取上清液分裝于1.5 mL離心管中保存?zhèn)溆眉纯伞?/p>

1.2.3.2 HE染色 將肝臟組織從4%的福爾馬林中取出，脫水、石蠟包埋、切片、最后進(jìn)行HE染色，染色后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3.3 RT-PCR法檢測TNF-a和IL-6 mRNA表達(dá) 采用天根總RNA提取試劑盒提取肝臟中總RNA，提取完成后取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)率完成后擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后給予72 ℃總延伸5 min。完成后，每組各取5 μL PCR產(chǎn)物，0.5%的瓊脂糖電泳，電泳完成后，凝膠成像儀采集圖像，Image J計算每個條帶熒光強(qiáng)度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

1.2.3.4 Western blotting檢測TNF-a和IL-6蛋白表達(dá) 總蛋白提取液提取總蛋白后，每組各取60 μg用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離。電泳完成后立即轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜（半干轉(zhuǎn)移法），轉(zhuǎn)移完成后3%脫脂牛奶封閉2 h，完成后加入相應(yīng)1抗，（1∶2 000）封閉袋中搖床1 h，之后至于4 ℃冰箱中過夜孵育；次日，洗滌3次后，加入相應(yīng)二抗（1∶5 000）孵育2 h、洗滌3次后，立即進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法曝光，之后壓片。凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)印跡條帶灰度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況 全程可見正常組大鼠活潑好動，毛發(fā)發(fā)白，飲食和飲水均正常，模型組大鼠則有明顯的飲食和飲水增加，但是精神和空白組差別不大，主要不同為毛色發(fā)黃，同時明顯消瘦，觀察組大鼠間于正常組與模型組之間。

2.2 HE染色 HE染色可見正常組大鼠肝臟肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紋理清晰，均以中央靜脈放射狀排列。模型組則表現(xiàn)有明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，同時肝細(xì)胞明顯腫大，此外肝組織有大量的脂肪空泡和脂肪變性；玉米須總皂苷治療4周后，其肝細(xì)胞仍有一定的腫脹和脂肪變性，治療8周后則有明顯的好轉(zhuǎn)，只有較少的脂肪空泡，肝細(xì)胞大小也基本恢復(fù)到正常。見圖1。

2.3 血糖和胰島素水平 與正常組比較，模型組空腹血糖（FBG）明顯升高（P<0.05），F(xiàn)INS（空腹胰島素水平）明顯降低（P<0.05），玉米須總皂苷治療4周后，空腹血糖含量明顯降低（P<0.05），胰島素水平明顯升高（P<0.05），治療8周后FBG進(jìn)一步降低（P<0.05），F(xiàn)INS進(jìn)一步升高（P<0.05）。見表2。

2.3 血脂水平變化 與正常組比較，模型組TG含量明顯升高（P<0.05），HDL-C含量明顯降低（P<0.05），玉米須總皂苷治療4周后，TG含量明顯下降（P<0.05），HDL-C含量明顯升高（P<0.05），治療8周后進(jìn)一步改善。見表3。

2.4 大鼠氧化和抗氧化能力的變化 與正常組比較，模型組SOD明顯下降（P<0.05），MDA含量明顯升高（P<0.05），玉米須總皂苷治療4周后，SOD明顯升高，MDA含量明顯降低，治療8周后進(jìn)一步改善（P<0.05）。見表4。

2.5 蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組IL-6和TNF-a蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05），玉米須總皂苷治療4周后，其含量明顯有一定程度的下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療8周后則明顯下降（P<0.05）。見圖2，表5。

2.6 mRNA表達(dá) 與正常組比較，模型組IL-6和TNF-a mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05），玉米須總皂苷治療4周后，其含量明顯有一定程度的下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療8周后則明顯下降（P<0.05）。見圖3，表6。

3 討論

2型糖尿病脂代謝異常是造成2型糖尿病并發(fā)癥的危害之一，特別是2型糖尿病并發(fā)動脈硬化[7]。有研究報道2型糖尿病動脈硬化發(fā)病率是普通人群的2～4倍[8]，因此關(guān)注和研究2型糖尿病脂代謝具有十分積極的意義。一般而言，糖尿病的血脂異常主要包括脂代謝數(shù)量和質(zhì)量的異常，其典型脂譜包括高三酰甘油和低密度脂蛋白血癥2個重要方面，對于低密度脂蛋白通過嚴(yán)格控制攝入可較好控制，但是對于高三酰甘油血癥調(diào)控較難，這主要是由于TG生成除攝入外，自我的調(diào)節(jié)和合成也是重要的一面，特別是肝臟，肝臟細(xì)胞是胰島素受體分泌較多的地方之一，當(dāng)血糖升高后，可造成胰島素抵抗指數(shù)的增加，在胰島素抵抗指數(shù)的增加下可造成游離脂肪酸流入肝臟增多，最終造成VLDL的過度合成，VLDL過高可造成機(jī)體清除TG發(fā)生障礙，最終造成了高三酰甘油血癥的發(fā)生[9-13]。而三酰甘油的增加，造成了肝臟中脂質(zhì)的聚集，最終造成肝臟脂肪肝的發(fā)生，此外其也會造成血液中TG的增加，引起患者動脈硬化甚至冠心病的發(fā)生[14]。

IL-6和TNF-α是目前公認(rèn)的影響2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的重要炎性反應(yīng)因子，IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在病理狀態(tài)下，其他相關(guān)細(xì)胞也可以產(chǎn)生，其升高可以反應(yīng)體內(nèi)炎性反應(yīng)的狀態(tài)，還可以引起相應(yīng)病理損傷，從而參與2型糖尿病的發(fā)展[15]。此外，IL-6也可能參與了2型糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的形成，其形成機(jī)制主要為減少肝臟細(xì)胞膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4（GLUT-4）表達(dá)，從而降低脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性，最終促進(jìn)血液中血脂的升高，最終造成動脈硬化甚至冠心病的發(fā)生[16]。TNF-α與IL-6稍有不同，TNF-α與免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)因子以及促凝血止血等密切相關(guān)，其也參與了2型糖尿病患者的發(fā)生和發(fā)展[17]。在2型糖尿病患者中，由于肝臟細(xì)胞長期受到高脂和高糖的浸潤，造成了其體內(nèi)血小板功能和血液循環(huán)均發(fā)生異常，血小板功能和血液循環(huán)障礙的異常，可造成凝血酶異常，進(jìn)而造成TNF-α的過量分泌，TNF-α的升高可反作用于肝細(xì)胞，進(jìn)而使得肝細(xì)胞表面的胰島素受體底物-1的絲氨酸殘基磷酸化，降低了肝細(xì)胞對胰島素的敏感性，最終造成體內(nèi)糖脂代謝的異常[18-19]。

我國是玉米種植大國，早在古代，就有中醫(yī)專家采用玉米須來治療糖尿病的研究，而近年來隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，進(jìn)一步證實(shí)了玉米須的作用，其不僅對降糖，同時對包括降脂特別是降低體內(nèi)膽固醇具有很好的療效[20-21]。此外，藥學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，對于降脂，玉米須總皂苷和玉米須多糖都有一定的作用，而其中發(fā)揮主要作用的為玉米須總皂苷[22]。本研究用玉米須總皂苷治療2型糖尿病大鼠，研究結(jié)果顯示：玉米須總皂苷可明顯改善2型糖尿病大鼠肝功能，調(diào)節(jié)血脂，最終促進(jìn)肝臟脂肪顆粒的排出，此外RT-PCR以及Western檢測肝臟組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)，結(jié)果顯示，玉米須總皂苷可以明顯降低2型糖尿病IL-6和TNF-α的表達(dá)。提示：玉米須總皂苷對2型糖尿病大鼠炎性反應(yīng)因子有一定的改善作用。

綜上所述，玉米須總皂苷可明顯改善2型糖尿病血脂，提高抗氧化能力，這與其可以調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6表達(dá)有關(guān)。

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