李昂 黃靜 劉旭 步洪石 劉馨晨 王淑敏
中圖分類(lèi)號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2018)13-1772-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.11
摘 要 目的:研究白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)慶大霉素(GM)所致大鼠急性腎衰竭的改善作用。方法:將50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(尿毒清顆粒,2 g/kg)和白耙齒菌固體發(fā)酵物低、高劑量組(2、4 g/kg),每組10只。除空白對(duì)照組外,其余各組大鼠均連續(xù)7d腹腔注射GM(140 mg/kg)復(fù)制急性腎衰竭模型。給藥組大鼠每天在造模2 h后灌胃給藥1次,空白對(duì)照組和模型組在相應(yīng)時(shí)間灌胃等量生理鹽水;造模結(jié)束后,各組大鼠再連續(xù)給藥7 d,每天給藥1次。給藥結(jié)束后,檢測(cè)大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)和右腎組織中白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量,蘇木精-伊紅染色后觀察大鼠左腎組織病理學(xué)變化。結(jié)果:與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠Scr、BUN、Ucr和右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著增加(P<0.01);左腎組織發(fā)生腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、變性、細(xì)胞核消失以及管腔內(nèi)蛋白樣沉積增多等病理學(xué)變化。與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組大鼠Ucr和白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組大鼠BUN以及白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著減少(P<0.05或P<0.01);同時(shí)給藥組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著減少(P<0.05或P<0.01);左腎組織的炎癥浸潤(rùn)減輕、腎小管和血管的增生受到抑制,病理學(xué)變化得到明顯改善。結(jié)論:白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)GM所致急性腎衰竭具有一定的改善作用。
關(guān)鍵詞 白耙齒菌;固體發(fā)酵物;急性腎衰竭;慶大霉素;大鼠
ABSTRACT OBJECTIVE: To study the improvement effects of Irpex lacteus solid fermentation products on gentamycin (GM)-induced acute renal failure in rats. METHODS: Fifty rats were randomly divided into blank control group, model group, positive control group (Niaoduqing granule, 2 g/kg) and Irpex lacteus solid fermentation products low-dose and high-dose groups (2, 4 g/kg), with 10 rats in each group. Except for blank control group, other groups were given GM (140 mg/kg) intraperitoneally for consecutive 7 d to induce acute renal failure model. Administration group was given relevant medicine intragastrically 2 h after modeling, once a day. Blank control group and model group were given constant volume of normal saline at corresponding time. After modeling, each group was given relevant medicine for consecutive 7 d, once a day. After medication, the contents of Scr, BUN, Ucr and IL-6, TNF-α in right renal tissue were detected. The pathological changes of left renal tissue was observed by HE staining. RESULTS: Compared with blank control group, the contents of Scr, BUN, Ucr and IL-6, TNF-α in right renal tissue were increased significantly in model group (P<0.01). The pathological changes of left renal tissue were observed, such as obvious renal tubular epithelial cell edema, degeneration, nucleus disappearance and the increase of protein-like deposition in the lumen. Compared with model group, the content of Ucr in positive control group and the content of BUN in I. lacteus solid fermentation products low-dose group and the contents of Scr, BUN, Ucr in I. lacteus solid fermentation products high-dose group were decreased significantly (P<0.05 or P<0.01); meanwhile, the contents of IL-6 and TNF-α in right renal tissue were decreased significantly in administration groups (P<0.05 or P<0.01). The inflammatory infiltration of left renal tissue was relieved, and renal tubules and vessels hyperplasia were inhibited; the pathological changes were improved significantly. CONCLUSIONS: I. lacteus solid fermentation products could improve GM-induced acute renal failure to certain extent.
KEYWORDS Irpex lacteus; Solid fermentation products; Acute renal failure; Gentamicin; Rats
慶大霉素(Gentamicin,GM)是臨床常用的抗感染藥物,因其以原型由腎排泄,使藥物大量蓄積在腎皮質(zhì)[1-3],這不僅增加了治療的風(fēng)險(xiǎn),也限制了GM 的臨床應(yīng)用。GM易引起腎損傷與功能性障礙,在所致腎損傷過(guò)程中,有大量促炎因子和趨化因子參與,并伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生。白耙齒菌(Irpex lacteus)又名白囊耙齒菌,屬于多孔菌目(Polyporales)皺孔菌科(Meruliaceae)耙齒菌屬(Irpex)的一種藥用真菌,生于闊葉樹(shù)的枯立木、枯枝上,民間常用于治療腎小球腎炎[4-5]。由于白耙齒菌在修復(fù)腎小球炎性損傷方面具有較好的功效,故本研究擬通過(guò)大鼠連續(xù)7 d腹腔注射GM建立急性腎衰竭模型,研究白耙齒菌固體發(fā)酵物對(duì)急性腎衰竭的改善作用,為白耙齒菌臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料
1.1 儀器
AUY220型精密電子天平(日本島津公司);TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南凱大科學(xué)儀器有限公司);CX31型生物顯微鏡(上海奮業(yè)光電儀器設(shè)備有限公司);FLUOstar Omega型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(廣州伯齊科技有限公司)。
1.2 藥品與試劑
尿毒清顆粒(廣州康晨藥業(yè)有限公司,批號(hào):20150419,規(guī)格:5 g/包,給藥前用生理鹽水分散);硫酸慶大霉素注射液(河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司,批號(hào):1603101,規(guī)格:2 mL ∶ 4萬(wàn)單位);血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)試劑盒和白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):均為20160906)。
1.3 動(dòng)物
健康清潔級(jí)SD大鼠50只,♂,體質(zhì)量180~220 g,由遼寧生物制品有限責(zé)任公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(遼)2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)觀察環(huán)境的溫度為24~25 ℃,濕度為(60±10)%。
1.4 菌株
白耙齒菌CZ-81保存于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)菌物藥研究室。
2 方法
2.1 白耙齒菌固體發(fā)酵物的制備
將薏米和麥麩以2 ∶ 1的質(zhì)量比混合,滅菌后制成培養(yǎng)基。將白耙齒菌CZ-81接種于培養(yǎng)基上,25 ℃條件下培養(yǎng),待其長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基后,烘干,粉碎,即得(給藥前用生理鹽水分散)。
2.2 分組、造模與給藥
將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組,分別為空白對(duì)照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(尿毒清顆粒,2 g/kg,為臨床用量的等效劑量)和白耙齒菌固體發(fā)酵物低、高劑量組[2、4 g/kg,根據(jù)臨床益腎康膠囊(白耙齒菌液體發(fā)酵物的出膏率約40%)服用量(1.2~1.8 g/d)換算而得],每組10只。除空白對(duì)照組大鼠注射生理鹽水外,其余各組大鼠均每天腹腔注射GM(140 mg/kg)1次,連續(xù)注射7 d,制備急性腎衰竭模型[6-10]。每天在注射GM 2 h后,灌胃給藥,連續(xù)給藥7 d。在造模結(jié)束后,大鼠再連續(xù)給藥7 d,共給藥14 d。
2.3 標(biāo)本采集
在實(shí)驗(yàn)第13天,大鼠禁食不禁水24 h,收集大鼠尿液,記錄尿量。在實(shí)驗(yàn)第14天,給藥4 h后用水合氯醛將大鼠麻醉,腹主動(dòng)脈取血,將血液在4 ℃ 條件下以4 037×g離心10 min,取血清備用。取血后將大鼠處死,迅速取兩側(cè)全腎,左腎固定在10%中性福爾馬林中,備用。所有尿液、血清和右腎樣本均置于-80 ℃冰箱中凍存,待檢。
2.4 生化指標(biāo)檢測(cè)
取血清,采用苦味酸比色法測(cè)定其中Scr含量,二乙酰肟法測(cè)定其中BUN含量;取尿液,采用苦味酸比色法測(cè)定其中Ucr含量;取右腎制成10%腎皮質(zhì)勻漿,ELISA法測(cè)定腎組織中IL-6、TNF-α含量。以上操作均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
2.5 腎組織病理學(xué)觀察
取用10%中性福爾馬林固定24 h后的左腎組織,常規(guī)石蠟包埋切片(厚度4 ?m),用二甲苯脫蠟,梯度乙醇漂洗,切片用蘇木精-伊紅(HE)染色,然后在顯微鏡下觀察腎組織病理變化。
2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用GraphPad prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以x±s表示,采用單因素方差分析,方差齊性組間比較采用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 大鼠生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果
與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著增加(P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組大鼠Ucr和白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組大鼠BUN以及白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。各組大鼠Scr、BUN、Ucr含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
3.2 右腎組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定結(jié)果
與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量顯著增加(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和白耙齒菌固體發(fā)酵物低、高劑量組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著減少(P<0.05或P<0.01)。各組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
3.3 病理學(xué)觀察結(jié)果
與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠左腎組織病變非常明顯,腎小管上皮細(xì)胞具有明顯的病變、水腫、變形或細(xì)胞核消失癥狀,而且小血管高度擴(kuò)張,管腔內(nèi)蛋白樣沉積物增多,腎小管有壞死并伴有間質(zhì)纖維化程度加深,腎間質(zhì)炎性細(xì)胞有灶性浸潤(rùn)。與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組大鼠左腎組織病理病變不明顯,偶見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞水腫和變形;白耙齒菌固體發(fā)酵物低劑量組大鼠腎小管擴(kuò)張不明顯,腎間質(zhì)出現(xiàn)少量炎癥浸潤(rùn),改善效果明顯;白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠血管擴(kuò)張不明顯,未見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、變形,改善效果要優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。各組大鼠左腎組織病理切片見(jiàn)圖1。
4 討論
模型組大鼠連續(xù)7 d腹腔注射GM后,尿量呈上升趨勢(shì),Scr、BUN、Ucr的含量均增加,與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中,Scr和BUN含量是衡量腎功能正常與否的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果提示,模型大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)功能和腎小管重吸收功能同時(shí)受損,這與文獻(xiàn)報(bào)道的GM可引起大鼠非少尿型的急性腎衰竭一致[8],證明模型建立成功。白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr的含量比模型組顯著降低(P<0.05),提示白耙齒菌固體發(fā)酵物具有減輕腎小球和腎小管功能受損的作用。病理結(jié)果也顯示,給予白耙齒菌發(fā)酵物后模型大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞灶性浸潤(rùn)減輕,白耙齒菌發(fā)酵物高劑量組大鼠未見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫、變形。同時(shí),給藥組大鼠腎組織中的炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。由此可以說(shuō)明,白耙齒菌固體發(fā)酵物可有效抑制腎組織炎癥反應(yīng),具有抑制腎損傷的作用,可用于防治急性腎衰竭。
中成藥尿毒清顆粒是臨床用于治療腎衰竭的常用藥物,適用于氮質(zhì)血癥期、尿毒癥早期以及中醫(yī)辨證屬脾虛濕濁癥和脾虛血瘀癥者,可降低Scr、BUN含量和穩(wěn)定腎功能、減少蛋白尿的排泄、抑制腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、延緩腎纖維化等[11-13],因此本研究以其為陽(yáng)性對(duì)照藥。從本研究結(jié)果可以看出,不管是Scr、BUN、Ucr的含量,還是腎組織中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量,白耙齒菌固體發(fā)酵物組大鼠的變化均優(yōu)于給予尿毒清顆粒的陽(yáng)性對(duì)照組,尤其是白耙齒菌固體發(fā)酵物高劑量組。本實(shí)驗(yàn)中有的實(shí)驗(yàn)組存在組間數(shù)據(jù)偏差過(guò)大的情況,這可能是由于大鼠個(gè)體差異帶來(lái)的異常值。
綜上所述,白耙齒菌固體發(fā)酵物在治療氨基糖苷類(lèi)抗生素(如GM)所致的急性腎衰竭方面具有開(kāi)發(fā)價(jià)值,本研究為今后白耙齒菌固體發(fā)酵物的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),也為保腎藥物的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
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(收稿日期:2017-12-04 修回日期:2018-05-15)
(編輯:林 靜)