張軍霞 郭姣梅 周繼春 李振國 陳煒 張振中

中圖分類號 R927.1；R932 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1806-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.19

摘 要 目的：建立定量檢測4種清熱解毒類中藥注射液中細菌內毒素的試驗方法。方法：采用動態(tài)顯色法，測定溫度為（37±0.5） ℃，檢測波長為405 nm，預設吸光度（A）值為0.1，反應時間為3 600 s。依據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）通則細菌內毒素檢查法中的光度測定法及其指導原則，進行標準曲線可靠性試驗和干擾試驗，確定4個品種（清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液）的最大不干擾濃度并進行細菌內毒素定量檢測。結果：可靠性試驗中標準曲線的相關系數(shù)r為0.999；清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液分別在原液200、125、75、12.5倍及以下稀釋倍數(shù)時對鱟試劑檢測無干擾作用；干擾試驗中回收率均在50%～200%；樣品中細菌內毒素含量分別小于1.66、1.04、0.62、0.104 EU/mL，均低于各樣品規(guī)定的限值。結論：采用動態(tài)顯色法可檢測這4種中藥注射液的細菌內毒素，且方法簡單快捷，結果穩(wěn)定可靠。

關鍵詞 動態(tài)顯色法；清熱解毒類；中藥注射液；細菌內毒素；干擾試驗

ABSTRACT OBJECTIVE： To set up the method for quantitative determination of bacterial endotoxin in 4 kinds of heat-clearing and detoxifying TCM injections. METHODS： The kinetic chromogenic assay （KCA） method was used. The determination conditions included detection temperature （37±0.5） ℃， detection wavelength 405 nm， preset absorbance （A） 0.1， and reaction time 3 600 s. According to photometry method and guidance principle general rule of bacterial endotoxin test in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）， reliability test and interference test of standard curve were conducted. The non-interference concentration of 4 type （Qingkailing injection， Compound Banbianlian injection， Yinzhihuang injection and Shuanghuanglian injection） was determined and quantitative determination of bacterial endotoxin was also conducted. RESULTS： The correlation coefficient r of standard curve was 0.999. Qingkailing injection， Compound Banbianlian injection， Yinzhihuang injection and Shuanghuanglian injection didnt interfere with the detection of tachypleus amebocyte lysate in 200， 125， 75 and 12.5 times and below dilution times respectively. The recoveries were 50%-200%， and the contents of bacterial endotoxin in samples were 1.66， 1.04， 0.62， 0.104 EU/mL， which were all lower than the limits of samples. CONCLUSIONS： KCA is suitable for the detection of bacterial endotoxin in 4 kinds of TCM injections. The method is simple， convenient， stable and reliable.

KEYWORDS Kinetic chromogenic assay； Heat-clearing and detoxifying； TCM injection； Bacterial endotoxin； Interference test

清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液這4種中藥注射液均具有清熱解毒功效，臨床療效顯著[1-8]。但隨著其在臨床應用的日益廣泛，不良反應報道也明顯增加[9-11] 。目前，僅清開靈注射液收載在2015年版《中國藥典》（一部）中，其余3種分別收載在《國家中成藥標準匯編：中成藥地方標準上升國家標準部分：眼科 耳鼻喉科 皮膚科 分冊》（復方半邊蓮注射液）、國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準WS3-B-2104-96-2010（雙黃連注射液）和WS3-B-2736-97（茵梔黃注射液）中。這4種中藥注射液的熱原檢查方法均為家兔熱原法，該方法為限量方法，靈敏度較低，重現(xiàn)性不好。同時這4種均有清熱作用，有內毒素污染時家兔升溫可能會受藥品本身藥理作用的影響，即其升溫作用可能被一定程度地抑制，從而影響熱原物質的檢查。細菌內毒素檢查法具有高靈敏度、穩(wěn)定性好、可定量檢測等優(yōu)點，可以更科學地反映該類藥物內毒素的污染情況。

細菌內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的脂多糖成分，極微量（1～5 ng/kg）的內毒素進入人體即可引起發(fā)熱反應[12]；大劑量的細菌內毒素可引起機體發(fā)生內毒素休克、彌散性血管內凝血、多器官衰竭等反應甚至死亡[13-15]。故注射液中應嚴格控制細菌內毒素含量，以保證注射液的安全性。中藥材由于生長、儲存、運輸、生產過程的特殊性，易受到微生物污染，加之細菌內毒素本身具有水溶性、耐熱性、吸附性及不揮發(fā)性等性質[16]，使中藥注射液中的細菌內毒素去除有一定難度，故對中藥注射液內毒素檢測方法的靈敏性和可靠性要求更高。動態(tài)顯色法（Kinetic chromogenic assay，KCA）是光度測定法中顯色基質法中的一種方法，是根據(jù)游離的對硝基苯胺的吸光度變化率與細菌內毒素濃度成正比關系，或反應混合物的吸光度到達事先設定的反應液吸光度變化值所需要時間的對數(shù)值與細菌內毒素濃度的對數(shù)值成反比關系而進行測定的一種方法。該方法靈敏度高、適用性強、操作簡便，可批量檢測故能節(jié)約時間和成本。本研究采用KCA對上述4種清熱解毒類中藥注射液的細菌內毒素含量進行檢測，以建立4種中藥注射液中細菌內毒素的定量檢測方法。

1 材料

1.1 儀器

Multiskan FC型內毒素儀（賽默飛世爾科技公司）；BioProde 生物探針5.2（湛江安度斯生物有限公司）；2H-2 BLENDER渦旋振蕩混合器（天津藥典標準儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

清開靈注射液（河南省神農藥業(yè)有限公司，批號：1608041、16071102、16040401，規(guī)格：10 mL/支）；復方半邊蓮注射液（河南同源制藥有限公司，批號：161201、170401、170701，規(guī)格：2 mL/支）；茵梔黃注射液（神威藥業(yè)集團有限公司，批號：170611D1、170612D2、170613D3，規(guī)格：10 mL/支）；雙黃連注射液（河南福森藥業(yè)集團有限公司，批號：1602021、1604363、1604413，規(guī)格：20 mL/支）；細菌內毒素工作標準品（CSE，批號：150601- 201783，規(guī)格：80 EU/支）、細菌內毒素檢查用水（BET水，批號：160001-201704，規(guī)格：5 mL/支）均來源于中國食品藥品檢定研究院；KCA鱟試劑（批號：1604220，規(guī)格：0.35 mL/支，定量范圍：20～0.01 EU/mL）、細菌內毒素檢查反應板（批號：1510080）均來源于湛江安度斯生物有限公司。

2 方法

2.1 供試品細菌內毒素限值的確定

細菌內毒素限值（L）=K/M，K為人每千克體質量每小時可接受的最大細菌內毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h）。首先去除稀釋液的最大允許細菌內毒素含量（K0），供試品的Ks=K-K0；M為人每千克體質量每小時可接受的最大供試品劑量，以mL/（kg·h）表示。按供試品說明書規(guī)定，取每日人用最大體積V進行計算，人均體質量按60 kg計算，假設供試品用250 mL葡萄糖注射液或氯化鈉注射液稀釋，則給藥時間按1 h計算，M=V/（60×1）。根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定[17]，由于藥物使用途徑不同，為保證安全用藥，藥品的L確定為計算值的 1/2～1/3，故本文一律取計算值的1/3作為各供試品的L。通過各品種的藥品說明書計算得清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液的L分別為2.0、5.0、3.0、1.0 EU/mL。

2.2 標準曲線可靠性試驗

參照KCA鱟試劑說明書，按2015年版《中國藥典》（四部）方法操作[17]。取CSE 1支，加BET水800 μL，渦旋振蕩15 min；取適量，用BET水稀釋成1.0、0.1、0.01 EU/mL 3個濃度，同時設陰性對照管。另取KCA鱟試劑，加0.35 mL BET水，充分溶解。取上述CSE系列濃度溶液及鱟試劑溶液各25 μL，加至反應板上，每個濃度均平行設立3孔，陰性對照平行設立2孔。采用KCA，吸光度（A）測定條件：溫度（37±0.5） ℃；檢測波長405 nm；預設A值0.1，反應時間（T）3 600 s，儀器自動以T的對數(shù)值（lgT）為橫坐標，以質量濃度（c）的對數(shù)值（lgc）為縱坐標，繪制標準曲線，計算相關系數(shù)（r）。

2.3 供試品干擾試驗

2.3.1 細菌內毒素系列溶液（C溶液） 標準曲線可靠性試驗中的1.0、0.1、0.01 EU/mL 3個濃度的CSE溶液，分別記為E1.0、E0.1、E0.01。

2.3.2 供試品溶液（A溶液）的稀釋 在不超過最大稀釋倍數(shù)（MVD）下用BET水對供試品進行稀釋，制成2倍稀釋的4個系列濃度的溶液，記為S1、S2、S3、S4。

2.3.3 供試品陽性對照溶液（B溶液）的制備 將0.1 EU/mL濃度的細菌內毒素設為λm。取S1倍稀釋的供試品與等量的0.2 EU/mL CSE溶液混合，即得到S2倍供試品稀釋液中含有濃度為0.1 EU/mL的細菌內毒素，記為S2T0.1。同樣制備S1T0.1、S3T0.1、S4T0.1一系列的供試品陽性溶液。

2.3.4 與KCA鱟試劑反應 取A、B、C溶液與KCA鱟試劑各25 μL，加至反應板上，每個濃度均平行設立2孔，BET水作為陰性對照（即D溶液），平行設立2孔。依照“2.2”項下條件測定。按照標準曲線所得回歸方程計算各供試品溶液和含標準細菌內毒素溶液的細菌內毒素含量ct和cS，按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。R=（cS-ct）/λm×100%，無干擾濃度下回收率應在50%～200%之間。

2.4 供試品細菌內毒素含量測定

依據(jù)干擾試驗所得供試品無干擾濃度，對供試品進行檢測，計算供試品細菌內毒素含量，以EU/mL表示，并進行樣品細菌內毒素回收率測定。

3 結果

3.1 標準曲線的可靠性

根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）[17]及鱟試劑使用說明書對光度測定法的規(guī)定：標準曲線的r的絕對值≥0.980，陰性對照的T大于標準曲線最低濃度（c）的T，反應重復管的變異系數(shù)（CV）≤10%。將標準曲線進行線性回歸，得到回歸方程為lgT=2.842 4-0.351lgc，│r│=0.999，陰性對照的T>3 600 s（標準曲線最低點反應的T為3 397.5 s），反應重復管的CV均≤10%。可見，標準曲線試驗成立，表明試驗有效。KCA標準曲線的可靠性試驗結果見表1。

3.2 供試品干擾試驗結果

清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液分別在200、125、75、12.5倍及以下濃度時回收率在50%～200%，表明在該稀釋倍數(shù)下不存在增強或抑制的干擾作用。因此，可以確定4種注射液的最大無干擾濃度分別為200、125、75、12.5倍。12批供試品干擾試驗結果見表2。

3.3 供試品中細菌內毒素的測定

使用系列濃度溶液生成的標準曲線（曲線方程lgT=2.842 4-0.351lgc，r=0.999）分別計算4個品種A溶液最大無干擾濃度下的細菌內毒素含量。結果，各組平行管細菌內毒素含量的CV均<10%；供試品管的T均>3 600 s；在最大無干擾濃度下各樣品細菌內毒素含量實測值均<0.008 3 EU/mL，表明清開靈注射液、復方半邊蓮注射液、茵梔黃注射液、雙黃連注射液原液細菌內毒素含量分別<1.66、1.04、0.62、0.104 EU/mL，均不超過各品種規(guī)定的細菌內毒素限值。

4 討論

清開靈注射液是在傳統(tǒng)古方安宮牛黃丸基礎上研制而成的中藥復方制劑，為臨床常用的中藥注射劑之一，用于治療上呼吸道感染[1]、肺炎、高燒，具有解熱作用[2]，能有效抑制細菌內毒素等致熱原引起的家兔發(fā)熱反應。復方半邊蓮注射液由半邊蓮、半枝蓮、白花蛇舌草組成，所含化學成分主要為山梗菜堿、山梗菜酮堿、黃酮苷和皂苷等，具有清熱、利水、消腫、解毒等作用[3]。茵梔黃注射液是由茵陳提取物、梔子提取物、黃芩苷、金銀花提取物等提取物制成的中藥注射劑，具有清熱、解毒、利濕、退黃的功效[4]，臨床用于肝膽濕熱、 面目悉黃、 胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃赤，急性、遷延性、慢性肝炎等屬上述證候者。雙黃連注射液由金銀花、黃芩、連翹等藥材組成，具有抑菌、抗炎、抗病毒、增強肌體免疫功能等藥理作用，同時對流感病毒、呼吸道合胞病毒等感染有拮抗作用，用于外感風熱所致發(fā)熱、咳嗽、咽痛、上呼吸道感染、輕型肺炎、急性腭扁桃體炎等[5-6]。近年來雙黃連注射液已成為中醫(yī)醫(yī)院治療上呼吸道感染性疾病的首選藥物之一[7-8]。

自二十世紀八九十年代起，中藥抗細菌內毒素的作用開始引起廣大學者的重視。有研究[18]報道，大青葉提取物具有體外破壞細菌內毒素的作用，細菌內毒素與大青葉提取物接觸后，注入家兔體內未引起發(fā)熱效果。另有研究[19]報道，大黃能顯著抑制家兔細菌內毒素性發(fā)熱。故熱原法有可能不能檢出有清熱解毒作用的中藥注射液中所含細菌內毒素。本研究中選擇的4種中藥注射液均屬于清熱解毒類，故需建立體外的方法檢測這4種中藥注射液是否被細菌內毒素污染以及其中的細菌內毒素含量。結果，樣品中添加細菌內毒素后回收率均在50%～200%，表明方法準確。經體外檢測各樣品中細菌內毒素含量均遠遠低于規(guī)定的限值，與前期試驗中4種制劑采用家兔法檢測無熱原反應的結果相吻合。但本試驗未對家兔法進行深入研究，比如樣品受細菌內毒素污染后對家兔發(fā)熱的抑制作用有待進一步深入探討。

中藥注射液成分復雜，顏色較深，已有文獻報道的體外檢測方法，或不適用于某些中藥注射液品種[20]，或檢測方法較復雜，需多種試劑進行試驗[21]。而本試驗所采用的檢測方法，所用試劑簡單，大大簡化了試驗操作，且檢測濃度范圍廣，可檢測20～0.01 EU/mL濃度的細菌內毒素。由本試驗結果可知，由于檢測手段具有較高的靈敏度，故供試品有更大的MVD，在小于MVD的稀釋倍數(shù)下，供試品不存在干擾作用。且在添加不同濃度的CSE時，回收率均符合規(guī)定，結果較為穩(wěn)定。

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（收稿日期：2018-03-07 修回日期：2018-04-17）

（編輯：劉 萍）