鄭建雷 李忠杰 孫渴望 王海清

冠狀動脈粥樣硬化是多因素作用的慢性炎癥過程，其中高脂血癥和糖尿病是發(fā)生動脈粥樣硬化的主要危險因素[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)三七總皂甙（panax notoginseng saponins，PNS）具有改善血脂代謝、減輕和延緩動脈硬化進展的作用[2]。本研究進一步探討PNS對糖尿病和高脂飲食狀態(tài)下SD大鼠炎癥因子水平以及主動脈脂質(zhì)代謝基因的影響，為PNS用于治療動脈粥樣硬化提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 雄性2月齡SD大鼠46只，體重200～250g，由南京大學(xué)模式動物研究所提供，普通飼料飼養(yǎng)2周后，其中36只用于制造糖尿病模型。

1.2 材料和儀器 PNS（批號160902，純度88.2%，云南昆藥集團）；阿托伐他汀鈣片（Phizer公司，美國）；鏈脲佐霉素（STZ，Sigma公司，美國）；空腹血糖、血脂水平測定（Roche Diagnostics公司,德國）；大鼠TNF-α試劑盒（北京博凌科為公司）；大鼠IL-13試劑盒（上海百蕊生物科技有限公司），大鼠IL-1β試劑盒（上海依科賽生物科技有限公司），血糖儀（強生公司，美國）。 PCR引物(北京擎科生物有限公司)；TRIzol（Gibco BRI公司，美國）；RT-PCR 試劑盒（Genecopoeia公司，美國）；SYBR Green PCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技）；PCR擴增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）。RIPA裂解液、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)），兔抗TLR-4（Proteintech，美國）；兔抗 SB-RI（Proteintech，美國）；鼠抗ABCA1（Abcam，英國）；小鼠單抗 β-actin、HRP 標記羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL底物液（Thermo，美國）。

1.3 糖尿病大鼠建模、分組和干預(yù) 造模過程如下：大鼠禁食、禁水4h后，腹腔注射STZ溶液 [將STZ溶于0.1mol/L的檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5）中，終濃度為6.5mg/ml]；每只大鼠按65mg/kg劑量腹腔注射，注射后繼續(xù)禁水4h，隔日尾靜脈采血，測血糖在15mmol/L以上為造模成功[3]，共成功30只，按隨機數(shù)字表法分為高脂飲食合并糖尿病組（糖尿病組）、高脂飲食合并糖尿病PNS治療組（PNS組）、高脂飲食合并糖尿病他汀治療組（他汀組），每組10只，另10只未建模大鼠設(shè)為單純高脂飲食非糖尿病組（對照組）。4組大鼠均予高脂飲食喂養(yǎng)12周。高脂飲食成分：膽固醇3.0%，膽鹽0.5%，甲基硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，豬油10%，基礎(chǔ)料81.3%。第5周起，他汀組和PNS組在每天上午分別給予阿托伐他汀鈣片（美國輝瑞公司）20mg/kg體重灌胃，PNS 80mg/kg體重灌胃，對照組和糖尿病組予等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)8周，飼養(yǎng)期間飲水和飼料量不限。

1.4 大鼠體重、血糖血脂水平和血清炎癥因子水平測定 記錄試驗前和試驗結(jié)束時各組小鼠的體重。各組大鼠給予高脂飼養(yǎng)飲食或聯(lián)合藥物干預(yù)12周后處死。處死前禁食12h，不禁水，戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，經(jīng)心臟采血，血液經(jīng)3 000r/min離心所得血清儲存于-80℃冰箱中備用。分離的主動脈組織一部分用于冷凍切片，另一部分保存在-80℃冰箱，用于后續(xù)PCR和Western blot檢測。空腹血糖、TC、LDL-C和TG水平的測定采用標準法使用Hitachi 912分析儀（Roche diagnostics公司，德國）。血清炎性因子TNF-α，IL-13，IL-1β水平測定根據(jù)Elisa試劑盒的說明進行。

1.5 主動脈油紅染色 用干凈清潔的硅化載玻片粘取冷凍切片，等到切片干燥后加入60%異丙醇浸洗10min，油紅O工作液染色10min，60%異丙醇分化3～10s后水洗，Mayer蘇木精復(fù)染1min，自來水返藍，用濾紙吸干水分，甘油明膠封片。

1.6 qRT-PCR法檢測主動脈組織TLR4、SR-BI、ABCA1 mRNA表達 在Pubmed上尋找基因序列：借助Premier 5.0設(shè)計引物序列（見表1）。按 Trizol Reagent（Gibco BRL，美國）試劑盒說明書提取大鼠主動脈血管總 RNA，紫外分光光度計測量OD260/OD280，計算RNA純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Genecopoeia公司生產(chǎn)）說明操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行PCR 擴增。反應(yīng)條件：50℃，2min，95℃，10min；95℃，30s，60℃，30s，共40cycles，最后行融合曲線分析。PCR產(chǎn)物5μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過Gen Genius全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各條帶的光密度。熒光實時定量PCR數(shù)據(jù)：熒光實時定量PCR數(shù)據(jù)分析[采用相對性Ct（ΔΔCt）]作為定量方法進行比較，以β-actin為管家基因，校正每個樣品的Ct值。

1.7 Western blot檢測主動脈TLR-4、ABCA1和SR-BI蛋白表達 在每1ml冷Lysis Buffer溶液中加入5μl磷酸酶抑制劑，1μl蛋白酶抑制劑和5μl 100mM PMSF混勻，冰上保存數(shù)分鐘待用。每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入0.5～1ml冷Lysis Buffer，玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作；取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml預(yù)冷的離心管，4℃下12 000r/min離心5min；取上清液轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷離心管中，即為組織全蛋白提取物，分裝保存于-70℃?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白加熱變性，制作電泳膠，取總蛋白40μg經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉2h。TBST洗膜后分別加入β-actin（1∶200）,TLR-4（1∶1 000）、SR-BI（1 ∶500）和 ABCA1（1 ∶300）一抗，4℃孵育過夜。TBST洗膜10min 3次，再分別加入相應(yīng)的二抗，室溫下振蕩孵育2h。把膜移入暗室，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，根據(jù)條帶強弱，調(diào)整曝光時間。利用凝膠成像分析軟件Bandscan進行分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)后各組大鼠血脂、血清炎癥因子、空腹血糖和體重比較 見表2。

由表2可見，干預(yù)前各組體重?zé)o明顯差異，而干預(yù)后，糖尿病組、PNS組和他汀組體重比對照組明顯降低（均P＜0.01）。糖尿病組、PNS組和他汀組空腹血糖較對

表2 干預(yù)后各組大鼠血脂、血清炎癥因子、空腹血糖和體重比較

照組明顯升高（均P＜0.01）。與糖尿病組比較，PNS組和他汀組血清 TG、TC、TNF-α、IL-1β 和 LDL-C 水平均降低（均P＜0.05），與PNS組比較，他汀組LDL-C降低更為明顯（P＜0.01）。糖尿病組血清IL-13水平較對照組降低（P＜0.05），經(jīng)PNS和他汀干預(yù)后IL-13表達均有所升高，但與糖尿病組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 各組大鼠主動脈冷凍切片油紅染色結(jié)果 見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈冷凍切片油紅染色圖

由圖1可見，糖尿病組血管內(nèi)膜及外膜脂質(zhì)含量明顯增加；PNS組和他汀組主動脈內(nèi)膜及外膜的脂質(zhì)含量均明顯改善，他汀組主動脈脂質(zhì)含量降低更為明顯；對照組脂滴在主動脈血管上的表達最少。

2.3 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和 ABCA1 mRNA表達量比較 見圖2。

由圖2可見，糖尿病組大鼠主動脈組織的TLR-4 mRNA表達明顯較對照組升高（P＜0.01）。與糖尿病組比較，他汀組TLR-4 mRNA表達明顯降低（P＜0.01），SB-RImRNA和ABCA1mRNA表達明顯上調(diào)（均P＜0.01）；與糖尿病組比較，PNS組TLR-4 mRNA表達降低，SBRI mRNA和ABCA1 mRNA水平升高，但未達統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

圖2 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和ABCA1 mRNA表達量比較（與糖尿病組比較，**P＜0.01）

2.4 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表達比較 見圖3。

圖3 各組大鼠主動脈TLR-4、SR-BI和ABCA1蛋白表達比較（與糖尿病組比較，**P＜0.01；與他汀組比較，▲P＜0.05）

由圖3可見，與對照組比較，糖尿病組主動脈組織TLR-4蛋白明顯升高（P＜0.01），SB-RI蛋白和ABCA1蛋白表達明顯降低（均P＜0.01）。與糖尿病組比較，PNS組和他汀組TLR-4蛋白表達均明顯降低（均P＜0.01），SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表達均明顯升高（均P＜0.01）。而PNS組SR-BI蛋白和ABCA1蛋白表達水平均低于他汀組（均P＜0.05）。

3 討論

動脈粥樣硬化是血脂代謝異常、高血糖和高血壓等多因素作用下的慢性炎癥性疾病，它的發(fā)生、發(fā)展過程與血管局部及全身的炎癥反應(yīng)可能存在密切的關(guān)系，而血管內(nèi)皮細胞受損被認為是動脈粥樣硬化病變的始動因子[1，4]。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病組高脂喂養(yǎng)的SD大鼠主動脈內(nèi)膜和外膜脂質(zhì)含量增加，血清炎癥因子TNF-α和IL-1β表達增加，而抗炎因子IL-13表達降低，血管壁TLR-4基因和蛋白表達明顯升高，而逆膽固醇脂轉(zhuǎn)運的SR-BI和ABCA1在血管壁上表達降低。PNS和阿托伐他汀鈣干預(yù)后血清炎癥因子表達降低，主動脈血管壁SR-BI和ABCA1基因及蛋白表達上調(diào)。

炎癥反應(yīng)貫穿于動脈粥樣硬化的整個過程，高脂、高血糖狀態(tài)下，炎癥反應(yīng)更加劇烈[2，5]。本研究也觀察到類似的結(jié)果，糖尿病組SD大鼠的血清炎癥因子表達較對照組SD大鼠明顯升高。這與他汀具有調(diào)脂作用外，尚有抗炎的作用相關(guān)[6]。動脈粥樣硬化狀態(tài)下往往TNF-α和IL-1β等促炎癥因子表達增加，而抗炎因子如IL-13表達減少[7－8]。本研究中糖尿病組SD大鼠經(jīng)他汀治療后，除降低LDL外，明顯降低血清炎癥因子TNF-α和IL-1β表達，同時增加抗炎因子IL-13表達。既往的研究發(fā)現(xiàn)PNS具有抗炎、抗氧化的作用，改善不穩(wěn)定心絞痛患者的血清炎癥因子表達，改善冠心病心絞痛的臨床癥狀[9-10]。我們發(fā)現(xiàn)PNS具有類似于阿托伐他汀鈣降低TNF-α和IL-1β，以及升高IL-13水平的作用。然而，糖尿病組SD大鼠的體重明顯低于對照組，可能與STZ所致的糖尿病類似于臨床上的1型糖尿病，消瘦表現(xiàn)更為明顯，而與腹型肥胖為特征的2型糖尿病不同。他汀與PNS均不能有效改善STZ所致糖尿病大鼠的血糖和體重，這可能與PNS對糖尿病動脈粥樣硬化的干預(yù)作用不是通過調(diào)節(jié)血糖實現(xiàn)有關(guān)。

動脈粥樣斑塊中TLR-4表達明顯增加，促進清道夫受體CD36表達增強，促使巨噬細胞攝入oxLDL，加速泡沫細胞的破裂和斑塊的不穩(wěn)定[11]。SR-BI是第一個在分子水平確定的HDL的天然膜受體,促進膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運和代謝，具有抗動脈粥樣硬化的作用[12]；而ABCA1表達增加促進游離膽固醇結(jié)合到乏酯的新生HDL上，起著膽固醇的逆轉(zhuǎn)運作用，也具有改善動脈粥樣硬化的作用[13]。大量的研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥和糖尿病明顯降低ABCA1和SR-BI的基因表達，升高TLR-4的基因表達，而他汀類藥物有降低TLR-4表達與升高SR-BI和ABCA1基因表達作用，本研究與既往的報道相類似[14-15]。PNS具有調(diào)整血脂代謝的作用[2]，但PNS干預(yù)組SD大鼠后，LDL-C降低不如他汀組明顯，這可能與他汀具有更明顯抑制膽固醇合成的作用有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)PNS與他汀具有類似的上調(diào)SR-BI和ABCA1基因表達和降低TLR-4基因表達，但與糖尿病組SD大鼠無統(tǒng)計學(xué)差異，而蛋白水平比較存在差異，可能是PNS加強TLR-4、SR-BI和ABCA1基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)節(jié)有關(guān)，但具體機制有待于后續(xù)的研究。PNS降低主動脈脂滴的沉著，可能是通過調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白的表達，進而影響血脂的代謝和改善粥樣硬化的斑塊進展。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PNS具有降低糖尿病高脂喂養(yǎng)SD大鼠的炎癥因子表達，改善動脈粥樣硬化的慢性炎癥狀態(tài)，減緩高脂血癥、高血糖狀態(tài)對動脈粥樣斑塊的進展。本研究為進一步闡述PNS在分子水平上對動脈粥樣硬化的作用機制提供新的理論依據(jù)，也部分解釋了PNS改善心絞痛癥狀和穩(wěn)定斑塊可能是通過改善脂質(zhì)代謝和減輕炎癥的作用有關(guān)。