于紀(jì)棉 張玉琳 曾斌 黃素文 趙秀玲 王建峰 劉玉新

嗜肺軍團(tuán)菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的人畜共患病病原體，廣泛存在于天然淡水和人工水域等多種水體環(huán)境中。近些年我國(guó)幾大城市集中空調(diào)冷卻塔嗜肺軍團(tuán)菌污染調(diào)查結(jié)果顯示嗜肺軍團(tuán)菌污染嚴(yán)重：上海51.60%，江蘇鎮(zhèn)江15.00%～46.67%、深圳46.20%[1-3]。嗜肺軍團(tuán)菌感染人類的主要途徑為中央空調(diào)冷卻塔工作時(shí)形成的含菌氣溶膠，被免疫力低下的人群吸入，導(dǎo)致患者全肺發(fā)生炎癥反應(yīng)及肺部實(shí)質(zhì)性病變，從而導(dǎo)致致命的急性呼吸道感染，在我國(guó)已有小規(guī)模暴發(fā)及散發(fā)病例報(bào)道。由于軍團(tuán)菌性肺炎與其他肺炎不易區(qū)別，病死率可高達(dá)15%～20%[4-6]。當(dāng)前城市化進(jìn)程加快，大型建筑增多，城市人口居住密度增高，軍團(tuán)菌病爆發(fā)和流行的可能性亦增高。嗜肺軍團(tuán)菌可被巨噬細(xì)胞吞噬，但卻不能被其消滅，反而會(huì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、繁殖。嗜肺軍團(tuán)菌逃逸巨噬細(xì)胞的殺傷作用也是其具有極大致病性的主要原因。本研究通過(guò)構(gòu)建嗜肺軍團(tuán)菌體外感染巨噬細(xì)胞模型，檢測(cè)巨噬細(xì)胞感染后分泌細(xì)胞因子的變化，探索嗜肺軍團(tuán)菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存的分子機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；嗜肺軍團(tuán)菌ATCC33152購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司；BCYEα培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GE公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司；RNeasy Plant Mini Kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；EasyScript Fist-Stand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Green qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；Roche-LightCycler480Ⅱ熒光PCR儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司；DMi8倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)萊卡公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7 采用10%FBS的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液，置于含5%CO2的37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d傳代1次。使用時(shí)采用0.1%的胰酶消化使其懸浮，計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度為1×106個(gè)/ml，鋪于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 嗜肺軍團(tuán)菌培養(yǎng)及菌懸液制備 嗜肺軍團(tuán)菌接種BCYEα培養(yǎng)基，培養(yǎng)5d，分別挑取生長(zhǎng)狀況良好的菌落，于BCYEα液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后取等量菌體轉(zhuǎn)接至250 ml BCYEα液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期測(cè)定菌體的密度，用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS）稀釋成菌懸液，調(diào)整細(xì)菌濃度。

1.2.3 嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7 嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7參照熊麗娜等[7]方法，巨噬細(xì)胞RAW264.7以1×106/孔，鋪6孔板，根據(jù) OD600值調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度，按感染復(fù)數(shù)（MOI）為10感染巨噬細(xì)胞RAW264.7。培養(yǎng)體系為室溫800g離心10 min，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)1h，移除含菌液的培養(yǎng)基，加入含硫酸慶大霉素200 mg/L的新鮮DMEM培養(yǎng)基，相同條件下，處理1h以殺死細(xì)胞外的軍團(tuán)菌。移除培養(yǎng)基，PBS輕輕吹洗5次，加入含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基。分別于感染前、感染后6、12、24h用鑷子取片，PBS沖洗5次，倒扣于潔凈的載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察嗜肺軍團(tuán)菌在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)和增殖情況。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè) 分別在感染前、感染后6、12、24、36h取材，用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。按照RNeasy Plant Mini Kit試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，將細(xì)胞總RNA按照EasyScript Fist-Stand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，然后進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃，5min；40 個(gè)循環(huán)：95℃，15s；58℃，30s（收集熒光）；熔點(diǎn)曲線分析55～95℃。PCR反應(yīng)體系為：TransStart Green qPCR SuperMix 10μl，上游和下游引物各0.5μl（表1），cDNA模板2μl，雙蒸水補(bǔ)至20μl。測(cè)定IL-6、TNF-α、Caspase-1和 Bcl-2 4個(gè)基因，均由深圳華大基因公司合成，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量結(jié)果分析。

表1 各目的基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，不同時(shí)間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜肺軍團(tuán)菌在巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)的增殖情況 見(jiàn)圖1。

圖1 嗜肺軍團(tuán)菌在巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)的增殖情況（a：0h；b：6h；c：12h；d：24h）

由圖1可見(jiàn)，顯微鏡下，正常貼壁的巨噬細(xì)胞RAW264.7呈圓形，形態(tài)完整。嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后，其感染周期可大致分為3個(gè)階段，感染早期（0～12h）：嗜肺軍團(tuán)菌被巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬后，會(huì)形成一個(gè)吞噬泡（圖1b箭頭所示），細(xì)菌形成明顯的復(fù)制囊泡并在其中生長(zhǎng)繁殖。快速增殖期（12～24h）：細(xì)菌形成明顯的復(fù)制囊泡并在其中生長(zhǎng)繁殖，并與周圍囊泡逐漸融合形成一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)大囊泡（圖1c箭頭所示）。傳播期（24h后）：巨噬細(xì)胞RAW264.7膜出現(xiàn)崩解（圖1d箭頭所示），有規(guī)則外形的菌團(tuán)也隨之破裂，釋放出細(xì)菌，細(xì)菌緩慢地運(yùn)動(dòng)，逐漸擴(kuò)散開(kāi)去，至此嗜肺軍團(tuán)菌完成了一個(gè)感染周期。

2.2 嗜肺軍團(tuán)菌對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞因子的影響 見(jiàn)圖2。

圖2 嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后IL-6、TNF-α、Caspase-1、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（與感染前比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖2可見(jiàn)，嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后，IL-6 mRNA的表達(dá)量變化非常顯著，感染6h后IL-6 mRNA的表達(dá)量（14.95）顯著上升，與感染前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.14，P＜0.01），之后 IL-6 mRNA 逐漸下降，但仍高于感染前，與感染前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.9、8.6、7.5，均P＜0.05）。TNF-α mRNA 表達(dá)量在感染 6、12、24 和 36h 后分別為 4.78、3.15、3.98、2.44，雖然其變化趨勢(shì)有所波動(dòng)，但與感染前比較仍顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.8、3.9、4.2、5.8，均P＜0.05）。Caspase-1 mRNA表達(dá)量在感染6h和12h時(shí)分別為2.13、2.04，與感染前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.3、9.5，均P＜0.05），感染 24h 和 36h 與感染前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Bcl-2 mRNA表達(dá)量在感染6、12和24h分別為4.10、3.99、2.48，與感染前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.3、6.6、4.3，均P＜0.05），感染36h后與感染前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

嗜肺軍團(tuán)菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，能感染并在人單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、表皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系中復(fù)制存活[8]。本研究是以巨噬細(xì)胞RAW264.7為宿主細(xì)胞模型，研究感染嗜肺軍團(tuán)菌后細(xì)胞因子的變化。

IL-6和TNF-α是導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)細(xì)菌感染后的保護(hù)性免疫反應(yīng)，因此在宿主免疫中起到很重要的作用。TNF-α一般認(rèn)為可由巨噬細(xì)胞內(nèi)源性分泌，參與細(xì)胞的增殖和分化、腫瘤的形成、細(xì)胞的凋亡、壞死等[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞RAW264.7感染嗜肺軍團(tuán)菌6h后，IL-6和TNF-α表達(dá)量顯著上升，之后隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)雖有所下降，但其表達(dá)量仍高于正常。佳莉娟等[10]在研究重組嗜肺軍團(tuán)菌鞭毛蛋白A（rflaA）感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7時(shí)也發(fā)現(xiàn)IL-6的表達(dá)水平顯著升高，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。在新近的報(bào)道中證明IL-6可以抑制由結(jié)核分枝桿菌感染引起的巨噬細(xì)胞自噬，IL-6的分泌量增加有利于結(jié)核分枝桿菌抑制機(jī)體先天性免疫應(yīng)答[11]。因此嗜肺軍團(tuán)菌能夠刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，大量分泌IL-6和TNF-α。IL-6幫助巨噬細(xì)胞降低自噬，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的磷酸化，從而誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)[12-13]，有利于嗜肺軍團(tuán)菌長(zhǎng)期存活。

Bcl-2是一種重要的凋亡抑制蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞的功能作用。Ge等[14]研究也表明嗜肺軍團(tuán)菌的效應(yīng)蛋白LegK1可以激活宿主的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)Bcl-2，使宿主細(xì)胞在感染后不會(huì)立刻啟動(dòng)具有保護(hù)作用的凋亡程序，利于嗜肺軍團(tuán)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存；另外，效應(yīng)蛋白SidF可直接與Bcl-2蛋白家族的成員相互作用，在感染過(guò)程中阻止宿主細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，感染6h后Bcl-2表達(dá)量顯著上升，其后表達(dá)量逐漸降低，但仍高于對(duì)照組，說(shuō)明嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7 6h后，可能是通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞RAW264.7的凋亡來(lái)完成自己在胞內(nèi)的增殖，本試驗(yàn)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也顯示嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7 6h后出現(xiàn)吞噬泡，細(xì)菌形成明顯的復(fù)制囊泡并在巨噬細(xì)胞RAW264.7中生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7 24h后，巨噬細(xì)胞RAW264.7胞膜出現(xiàn)崩解，有規(guī)則外形的菌團(tuán)也隨之破裂，并釋放出細(xì)菌，因而致使了Bcl-2在感染后期出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

有研究表明Caspase-1激活的程序性細(xì)胞死亡是細(xì)胞限制胞內(nèi)細(xì)菌感染的重要手段，嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞后，可激活Caspase-11，隨后通過(guò)NLRP3炎性小體和凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase-1[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞RAW264.7感染嗜肺軍團(tuán)菌初期，Caspase-1表達(dá)量顯著升高，后期表達(dá)量降低，由此可見(jiàn)嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7初期，細(xì)胞可以通過(guò)增加Caspase-1的表達(dá)從而激活細(xì)胞焦亡來(lái)限制嗜肺軍團(tuán)菌在其體內(nèi)的增殖。

綜上所述，嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后，細(xì)胞焦亡和抗凋亡兩種機(jī)制同時(shí)存在，從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，細(xì)菌感染初期，炎癥反應(yīng)比較激烈大量炎癥因子分泌，激活了細(xì)胞焦亡，但是從整個(gè)嗜肺軍團(tuán)菌感染過(guò)程來(lái)看，細(xì)菌可以在巨噬細(xì)胞RAW264.7中增殖，說(shuō)明焦亡只是感染初期的一個(gè)反應(yīng)，整個(gè)感染過(guò)程還是以抗凋亡為主，嗜肺軍團(tuán)菌感染巨噬細(xì)胞RAW264.7后發(fā)生炎癥反應(yīng)的確切機(jī)制仍需下一步的研究。