吳冰潔 董梅 李世平 薛芳 王銘維 詹海燕

隨著全世界人口平均壽命增加，受到認知功能減退和癡呆影響的人口比例越來越高，認知功能障礙正在成為影響人類健康和經(jīng)濟發(fā)展的問題之一[1-2]。 阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）的精神行為癥狀包括抑郁、焦慮等，這些會影響AD患者及其照顧者的生活[3]。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境和生活方式可影響AD病情進展[4-5]。環(huán)境豐富是指相較于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境而言，實驗動物周圍環(huán)境條件豐富，使其所處環(huán)境更為新穎和復(fù)雜，能增加動物的感官、認知、運動和社會參與刺激，進而豐富生活[6]；貧瘠環(huán)境是指缺少感官、認知、運動和社會刺激的環(huán)境，居住條件單一、閉塞[7]。目前有關(guān)環(huán)境對AD動物模型抑郁、焦慮情緒影響的研究較少。本研究選擇SAMP8小鼠為AD模型，觀察不同飼養(yǎng)環(huán)境下SAMP8雄性小鼠自主活動和高架十字迷宮實驗的表現(xiàn)，旨在探討不同環(huán)境對快速老化雄性小鼠抑郁、焦慮情緒的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性3月齡SAMP8小鼠30只，由香港中文大學(xué)解剖系姚大衛(wèi)教授贈送。入選小鼠經(jīng)過預(yù)選，有明顯缺陷（外部腫瘤、運動能力受限）的剔除。實驗前平均體質(zhì)量為（25.24±0.28）g，稱量體質(zhì)量后按隨機數(shù)字表分為3組：標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組、豐富環(huán)境組和貧瘠環(huán)境組。每組各10只。

1.2 環(huán)境設(shè)置 參照文獻[8-9]設(shè)置小鼠生活環(huán)境。3組均在室溫23～25℃的環(huán)境中生活，保持12 h照明、12 h黑暗的周期，自由進食、水，2～3 d清潔并更換1次。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組小鼠飼養(yǎng)于30 cm×18 cm×25 cm（長×寬×高）的透明玻璃籠內(nèi)，每籠5只，籠內(nèi)只有墊料（圖1A）。豐富環(huán)境組小鼠飼養(yǎng)于45 cm×28 cm×25 cm（長×寬×高）的透明玻璃籠內(nèi)，每籠5只，籠內(nèi)設(shè)有金屬制小橋、斜架，直徑3 cm PVC隧道，塑料跑籠，金屬鏈條，各種形狀及顏色的塑料玩具（球、盒、鈴鐺等），各種形狀及顏色的木制積木（圖1B）。貧瘠環(huán)境組小鼠飼養(yǎng)于18 cm×6 cm×15 cm（長×寬×高）的透明玻璃籠，每籠1只孤養(yǎng)，每個籠子之間用紙板隔開間距約4 cm（圖1C），小鼠之間絕對不能碰面。

圖1 小鼠飼養(yǎng)環(huán)境。 A標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境；B豐富環(huán)境；C貧瘠環(huán)境

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 體質(zhì)量 每周于固定時間測量各組小鼠體質(zhì)量及觀察記錄生活狀態(tài)。

1.3.2 自主活動（autonomic activities）小鼠飼養(yǎng)8周后測量該指標(biāo)。通過觀察小鼠進入熟悉并封閉的環(huán)境后各種自發(fā)活動，判斷其神經(jīng)精神變化，如抑郁癥狀等。ZH-YLS-2A小鼠自主活動儀（安徽淮北正華生物儀器有限公司生產(chǎn)）由4個直徑25 cm、高14 cm的圓形黑色活動箱組成（圖2A）。工作狀態(tài)下自主活動儀發(fā)射激光束，小鼠在活動時遮擋激光束，此信號傳到計算機中而被記錄為活動次數(shù)。小鼠在活動箱中適應(yīng)3 min后，計算機記錄6 min內(nèi)的活動次數(shù)。

1.3.3 高架十字迷宮實驗（elevated-plus maze test）小鼠飼養(yǎng)8周后測量該指標(biāo)。高架十字迷宮是焦慮相關(guān)研究中應(yīng)用最廣泛的實驗之一[10]。小鼠在開放區(qū)停留時間反映其焦慮程度。ZH-DSG高架十字迷宮 （安徽淮北正華生物儀器有限公司生產(chǎn)）包括兩條相對的開放臂（42 cm×15 cm）和兩條閉合臂 （42 cm×15 cm×20 cm）， 由中央?yún)^(qū)（15 cm×15 cm）聯(lián)結(jié)，閉合臂頂部為透明樹脂材料，周圍為灰色不透明樹脂材料，迷宮底板距地面60 cm（圖2B）。將小鼠面向開放臂放置在中央?yún)^(qū)，同時開始記錄5 min內(nèi)小鼠在開放臂停留的時間（以雙前肢進入為準(zhǔn)）。測試時室內(nèi)為暗光，室溫保持在（21±2）℃，距離1.5 m觀察記錄小鼠的活動。

圖2 行為學(xué)測試儀。 A自主活動儀；B高架十字迷宮

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。3組8周末體質(zhì)量、自主活動次數(shù)、高架十字迷宮實驗開放臂停留時間的數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，但不具方差齊性，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，組間比較采用方差分析（Welch法），豐富環(huán)境組和貧瘠環(huán)境組分別與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組進行兩兩比較，采用Dunnett's T3檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生活狀態(tài)和體質(zhì)量變化 8周末，豐富環(huán)境組小鼠毛發(fā)整齊，皮膚完整，能主動玩耍。豐富環(huán)境組與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組相比，有群體間互動現(xiàn)象，每次更換玩具時，對新異刺激物比較有興趣。貧瘠環(huán)境組在4～5周時，3只小鼠有程度不等的臀部皮膚咬傷，6周時有2只小鼠死亡。

在8周飼養(yǎng)過程中，豐富環(huán)境組小鼠體質(zhì)量呈先增長后下降趨勢；貧瘠環(huán)境組小鼠體質(zhì)量變化不大，呈曲折中逐漸下降趨勢；標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組體質(zhì)量呈先下降后增長趨勢（圖3）。8周末3組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.530，P=0.053）。

圖3 不同環(huán)境組行為測試前體質(zhì)量變化折線圖。SE為標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組；IE為貧瘠環(huán)境組；EE為豐富環(huán)境組

2.2 自主活動 飼養(yǎng)8周后，3組小鼠6 min內(nèi)的活動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=57.263，P＜0.001）。兩兩比較，豐富環(huán)境組與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.126），貧瘠環(huán)境組與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組活動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表1。

2.3 高架十字迷宮實驗 飼養(yǎng)8周后，3組小鼠高架十字迷宮開放臂停留的時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.224，P＜0.001）。 兩兩比較，豐富環(huán)境組與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.354），貧瘠環(huán)境組與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組開放臂停留時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見表 1。

表1 不同環(huán)境組小鼠行為學(xué)測試結(jié)果

3 討論

本研究以SAMP8雄性小鼠為AD模型，在不同環(huán)境下飼養(yǎng)8周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豐富環(huán)境中生活的SAMP8鼠群生活更為和諧，活動和互動較多；在貧瘠環(huán)境中生活的小鼠存在自殘、自殺傾向。3組小鼠8周末的體質(zhì)量尚不能認為存在差異。行為學(xué)測試方面，與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組比較，尚不能認為豐富環(huán)境對抑郁、焦慮情緒產(chǎn)生積極影響；但貧瘠環(huán)境可加重SAMP8小鼠的精神行為（抑郁、焦慮）異常。

快速老化小鼠（senescence-accelerated mouse,SAM）是一類顯示早衰的近交系小鼠系列,此系列由多個子系列組成，每個系列表現(xiàn)為不同的功能障礙。SAMP8為其中的一個子系列，有早期老化和加速老化的特點，表現(xiàn)為年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙、異常情緒改變、晝夜節(jié)律紊亂[11-12]，這些特征的產(chǎn)生可能與氧化應(yīng)激、炎癥、神經(jīng)元死亡通路激活、膽堿能缺陷、淀粉樣蛋白積累、老年斑形成等有關(guān)[13]。SAMP8小鼠在3月齡出現(xiàn)記憶力減退，4月齡能表現(xiàn)出焦慮、抑郁行為，而且隨月齡增加而癥狀加劇[14-15]。本研究在進行行為學(xué)測試時SAMP8小鼠已經(jīng)到達5月齡，因此已具有焦慮、抑郁等異常精神行為。HüTTENRAUCH等[10]研究以5XFAD小鼠為AD模型，發(fā)現(xiàn)環(huán)境豐富不能改善焦慮相關(guān)的行為缺陷。APP/PS1KI小鼠經(jīng)過4個月的豐富環(huán)境暴露后，焦慮水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化[16]。但是PIETROPAOLO等[17]和GORTZ等[18]的研究結(jié)果顯示環(huán)境豐富組AD小鼠焦慮相關(guān)行為減少。因此豐富環(huán)境對焦慮的作用仍存在爭議。至于對抑郁方面的研究，鮮少有實驗研究AD小鼠的生活環(huán)境對抑郁的影響。在貧瘠環(huán)境中生活的SAMP8小鼠，它們所接受的刺激減少，并且處于一種社會孤立狀態(tài)。既往研究表明，貧瘠環(huán)境可加重認知功能異常[19]和腦缺血損傷程度[20]，不利于情感認知體系形成[21]，對身體健康和情緒穩(wěn)定狀態(tài)造成負面影響。MEIJERS等[22]以監(jiān)獄中男囚犯為研究對象，發(fā)現(xiàn)監(jiān)禁3個月后，其自我控制力降低、注意力降低。在本研究中貧瘠環(huán)境組的小鼠有皮膚咬傷及死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，說明貧瘠環(huán)境可能促使SAMP8小鼠出現(xiàn)自殘、自殺傾向，提示這是一種情感調(diào)控失衡的表現(xiàn)。通過自主活動和高架十字迷宮實驗，更加印證了貧瘠環(huán)境可加劇SAMP8小鼠抑郁、焦慮情感異常程度的假設(shè)。

本研究存在一定不足。第一，本研究的目的在于探究不同環(huán)境對SAMP8雄性小鼠精神行為的影響，但是未對其分子機制、基因表達進行進一步探究。有研究表明豐富環(huán)境刺激可減輕氧化應(yīng)激（oxidative stress,OS）水平[23]，焦慮和 OS 之間存在很強的相關(guān)性，OS啟動后細胞因子增加，細胞因子高水平表達使小鼠表現(xiàn)為更高的焦慮狀態(tài)[3]。向大鼠注射原纖維蛋白Aβ1-42后，這種淀粉樣聚集物刺激腦內(nèi)活性氧生成、脂質(zhì)過氧化和海馬、皮層、紋狀體區(qū)抗氧化酶活性抑制，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，大鼠表現(xiàn)為焦慮和認知功能損害[24]。有氧運動通過降低腦組織中脂質(zhì)過氧化作用及提高抗氧化含量來降低氧化應(yīng)激，保護動物免受應(yīng)激影響，減少焦慮行為[25]。AD的抑郁障礙可能與炎癥通路激活有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)向動物注射淀粉樣β肽低聚物（oligomers of the amyloid-β peptide,AβO）， 其腦組織中白介素 1β（interleukin-1β,IL-1β）和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平明顯升高，在癥狀上表現(xiàn)為抑郁樣行為[26]。炎癥介質(zhì)增加會對情緒功能產(chǎn)生不利影響，豐富環(huán)境有助于下調(diào)IL-1β和TNF-α的表達[27]。豐富的環(huán)境刺激不僅能加強學(xué)習(xí)和記憶能力，還可以提高應(yīng)對恐懼、焦慮的能力。貧瘠環(huán)境減少了感官、運動和認知刺激、社會活動以及身體活動，使動物處于活動缺乏的狀態(tài)[28]。未來研究可著重關(guān)注環(huán)境對SAMP8小鼠精神行為的作用機制，研究機制主線路主要包括以下方面：①神經(jīng)形成和再生；②神經(jīng)凋亡和壞死的相關(guān)通路因子；③氧化應(yīng)激；④神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)系統(tǒng)。第二，豐富環(huán)境組和標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境組的自由活動次數(shù)和開放臂停留時間在均數(shù)上存在較大差異，但是該差異未有統(tǒng)計學(xué)上的意義，提示需要進一步擴大樣本量來進行研究。

本實驗的更高目的在于為臨床應(yīng)用提供證據(jù)。在實際生活中，AD患者往往在類似貧瘠的環(huán)境中生存，少刺激、少活動、少社交，患者焦慮、抑郁、日常生活能力下降，但可以通過定期給予認知和多感官刺激來增強其大腦可塑性[29]。生活環(huán)境豐富，多種形式的身體活動、感官刺激、社會交際會對AD產(chǎn)生眾多積極影響[30-33]。綜上，本研究結(jié)果提示，豐富環(huán)境使SAMP8雄性小鼠生活活躍、鼠間交流增多，但尚不能認為對焦慮、抑郁產(chǎn)生影響；貧瘠環(huán)境使SAMP8雄性小鼠活動力下降，產(chǎn)生自殺、自殘傾向，加重焦慮、抑郁癥狀。