吳永祥，畢淑峰，姜 薇，崔 譜，金有貞，金泰完

( 1. 黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 安徽 黃山 245041; 2. 安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，韓國(guó) 安東 760749 )

黑色素是由黑色素細(xì)胞合成的高分子生物色素，分布于皮膚真皮層中，決定了皮膚的顏色。適當(dāng)?shù)暮谏厣捎欣谄つw健康，可有效吸收紫外線，從而保護(hù)皮膚免受光老化的損傷；而黑色素過度合成不僅簡(jiǎn)單地使皮膚變黑，而且可直接或間接導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)雀斑、白癜風(fēng)等，甚至?xí)鹌つw癌，嚴(yán)重?fù)p害人體健康[1]。黑色素的生成含量主要受酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)的調(diào)節(jié)，TYR是黑色素起始反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶[2]。黑色素的生成速度和產(chǎn)量還受酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1(tyrosinase-related protein-1, TRP-1)、TRP-2、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia associated transcription factor , MITF)的調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，中草藥及植物中化學(xué)成分可有效抑制黑色素的生成。

桑白皮(CortexMori)史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，而歷代本草均有收錄，為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥材之一。桑白皮為桑的干燥根皮，主產(chǎn)地有安徽亳州、浙江淳安、江蘇泰興、四川通江等地。桑白皮的化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要含多酚類化合物、香豆素類化合物、芪類化合物、多糖等[6]。桑白皮多酚(polyphenol fromCortexMori，CMP)主要包括Diels-Alder型加合物和黃酮類化合物等，是桑白皮中一種非常重要的次生代謝產(chǎn)物，屬于桑屬植物的特征性成分之一[6]。現(xiàn)代藥理研究表明，CMP具有抗高血壓、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖、抑制脂肪細(xì)胞分化等功效[7-10]。雖然CMP藥理作用的研究較多，但關(guān)于CMP對(duì)α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)誘導(dǎo)的B16細(xì)胞內(nèi)黑色素生成抑制作用及機(jī)制的研究仍然缺乏。因此，本實(shí)驗(yàn)以小鼠B16細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達(dá)細(xì)胞模型，以熊果苷為陽性對(duì)照，研究CMP對(duì)α-MSH誘導(dǎo)的B16細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制作用，并初步探究其作用機(jī)制，以期為CMP在化妝品或藥品的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞株小鼠黑色瘤B16細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.2藥品與試劑胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含0.05% EDTA)，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；熊果苷(純度98%)、左旋多巴、MTT、二甲基亞砜、PBS粉劑，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；cDNA合成試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；TYR、TRP-1、TRP-2、MITF、β-actin抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；所有的熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research公司。

1.3儀器IX51型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；DL-CJ-1N型超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；NU-8500型 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；ECOTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Illumina公司)；SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1CMP的制備將干燥的桑白皮粉碎成粉末，按照料液比1 ∶10 (g·mL-1)與70%乙醇溶液混合， 180 r·min-1室溫條件下振蕩提取3次，每次4 h。過濾后，合并3次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適量，上大孔樹脂，吸附12 h，用蒸餾水洗脫，洗至Molish反應(yīng)為陰性，再依次使用不同純度的乙醇沖洗，收集洗脫液，濃縮冷凍干燥，得CMP粉末。采用Folin-Ciocalteu法[11]，以單寧酸(tannic acid, TA)為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制OD值(Y)與質(zhì)量濃度(X)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 0.001X - 0.005(r2= 0.999)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CMP的含量(mg TA·g-1)。

2.2B16細(xì)胞培養(yǎng)及分組小鼠黑色瘤B16細(xì)胞置于含10%胎牛血清、青鏈霉素(100 kU·L-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基(pH=7.2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2且相對(duì)飽和濕度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組(Control)、α-MSH模型組(Model)、陽性對(duì)照組(α-MSH誘導(dǎo)+熊果苷100 mg·L-1)、CMP組(α-MSH誘導(dǎo)+CMP 5、10、20 mg·L-1)。

2.3細(xì)胞活力的測(cè)定采用MTT法[12]測(cè)定細(xì)胞活力。取B16細(xì)胞以1×108·L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后按照實(shí)驗(yàn)分組加入不同藥液，CMP的終濃度為5、10、20 mg·L-1，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，各孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，3 h后輕輕吸去上清液，每孔加入200 μL DMSO溶液，震蕩均勻，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力：細(xì)胞相對(duì)活力/%=實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白對(duì)照組吸光值×100%。

2.4細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測(cè)定采用NaOH裂解法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量[13]。取B16細(xì)胞以5×107·L-1接種于12孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)24 h。按照實(shí)驗(yàn)分組加入0.2 μmol·L-1α-MSH進(jìn)行誘導(dǎo)(除空白對(duì)照組)，構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達(dá)細(xì)胞模型，再加入不同藥液，其中CMP的終濃度為5、10、20 mg·L-1，陽性對(duì)照熊果苷的終濃度為100 mg·L-1，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，用PBS清洗3次后，每孔加入200 μL 1 mol·L-1的NaOH溶液(含10% DMSO)，在80℃條件下充分裂解細(xì)胞1 h，于475 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光值。溶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法。按照同法，以黑色素為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制OD值(Y)與質(zhì)量濃度(X)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y = 0.009X + 0.00008 (r2=0.992)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量。按下列公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)黑色素相對(duì)含量：細(xì)胞內(nèi)黑色素相對(duì)含量/%=實(shí)驗(yàn)組每克蛋白質(zhì)中的黑色素含量/α-MSH模型組中每克蛋白質(zhì)中的黑色素含量×100%。

2.5細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測(cè)定采用L-Dopa氧化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性[14]。細(xì)胞分組處理同“2.4”，培養(yǎng)48 h后，棄去上清液，用PBS清洗3次，每孔加入含1% TritonX-100的PBS緩沖液500 μL，置于-80℃冰箱中冷凍1 h，隨后室溫融化，將細(xì)胞裂解液在12 000 r·min-1、4℃條件下離心20 min，收集上清液。取上清液60 μL于96孔板中，加入140 μL的5 mmol·L-1L-Dopa，37℃孵育1 h，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的吸光值。溶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradford法。按下列公式計(jì)算細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶相對(duì)活性：細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶相對(duì)活性/%=實(shí)驗(yàn)組每克蛋白質(zhì)中的酪氨酸酶活性/α-MSH模型組中每克蛋白質(zhì)中的酪氨酸酶活性×100%。

2.6TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白表達(dá)的測(cè)定采用不同濃度CMP(5、10、20 mg·L-1)處理B16細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按每個(gè)電泳孔道加入30 μg蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干式轉(zhuǎn)移至PVDF膜。分別加入TYR、TRP-1、TRP-2、MITF、β-actin的一抗(1 ∶1 000)進(jìn)行免疫印跡，再用1 ∶5 000稀釋的相對(duì)應(yīng)二抗進(jìn)行雜交。采用ELC反應(yīng)，暗室顯影，曝光。Bio-Rad軟件分析各電泳條帶的蛋白量，結(jié)果表示為各電泳條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值。

2.7TYR、TRP-1、TRP-2、MITFmRNA表達(dá)的測(cè)定采用不同濃度CMP(5、10、20 mg·L-1)處理B16細(xì)胞，48 h后利用TRIzol試劑提取總RNA，然后采用PrimeScriptTMRT試劑將RNA逆轉(zhuǎn)入為cDNA。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences used for TYR, TRP-1, TRP-2, MITF detection with qRT-PCR primers

3 結(jié)果

3.1CMP對(duì)細(xì)胞活力及α-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞黑色素含量的影響由Fig 1A可知，B16細(xì)胞經(jīng)不同濃度CMP(5、10、20 mg·L-1)處理24 h后，CMP對(duì)細(xì)胞活性沒有明顯影響，與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明后續(xù)實(shí)驗(yàn)均可采用此濃度進(jìn)行研究。構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達(dá)細(xì)胞模型，觀察CMP作用后細(xì)胞內(nèi)黑色素生成量的變化。由Fig 1B可知，B16細(xì)胞經(jīng)α-MSH誘導(dǎo)后，細(xì)胞黑色素的生成量明顯增加(P<0.05)，表明α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達(dá)細(xì)胞模型建立成功。與α-MSH模型組相比，陽性對(duì)照熊果苷作用后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制率達(dá)到(17.29±3.31)%；而CMP在濃度為20 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制率達(dá)到了(52.95±0.63)%，與α-MSH模型組相比，差異具有顯著性(P<0.05)，說明CMP對(duì)黑色素生成的抑制效果強(qiáng)于陽性對(duì)照熊果苷。

3.2CMP對(duì)α-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響如Fig 2所示，CMP和陽性對(duì)照熊果苷對(duì)B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性均呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，酪氨酸酶活性隨著CMP濃度的升高而降低，且呈劑量依賴性。與α-MSH模型組相比，當(dāng)CMP濃度為10、20 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制率分別為(17.43±1.06)%、(32.85±1.17)%，差異具有顯著性(P<0.05)；而熊果苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制率為(16.75±0.43)%，說明陽性對(duì)照熊果苷的作用效果沒有桑白皮多酚的效果明顯。結(jié)果表明，CMP在一定程度上通過抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性，抑制黑色素的產(chǎn)生。

Fig 1 Effect of CMP on cell viability (A) and α-MSH induced melanin content (B) in B16 cells n=3)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of CMP on α-MSH induced tyrosinase activity in B16 cells n=3)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

3.3CMP對(duì)細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITFmRNA表達(dá)的影響由Tab 2可知，與空白對(duì)照組相比，B16細(xì)胞經(jīng)α-MSH誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA的表達(dá)水平均明顯升高，分別是空白對(duì)照組的2.63、2.04、1.92、7.41倍。CMP明顯抑制了α-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA的表達(dá)水平，隨著CMP濃度的增加，抑制效果呈濃度依賴性增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與α-MSH模型組相比，當(dāng)CMP濃度為20 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA表達(dá)的抑制率分別73.31%、59.32%、58.56%、83.95%。

Tab 2 Effect of CMP on α-MSH induced TYR, TRP-1, TRP-2, MITF mRNA levels in B16 cells n=3)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.4CMP對(duì)細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白表達(dá)的影響Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，B16細(xì)胞經(jīng)α-MSH誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。結(jié)果證實(shí)了B16細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF表達(dá)量的升高，將促進(jìn)黑色素的生成。當(dāng)CMP濃度為10、20 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白表達(dá)量明顯低于α-MSH模型組，且差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)果表明，CMP能夠明顯下調(diào)α-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF的蛋白表達(dá)。

4 討論

本研究以小鼠B16細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達(dá)細(xì)胞模型，首先研究了CMP對(duì)B16細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，CMP在濃度為5～20 mg·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用，可采用此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以熊果苷為陽性對(duì)照，本研究檢測(cè)了CMP對(duì)α-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)黑色素含量及酪氨酸酶活力的影響。結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)α-MSH誘導(dǎo)后，細(xì)胞黑色素生成量及酪氨酸酶活性明顯增加，與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性，表明α-MSH誘導(dǎo)的黑色素高表達(dá)細(xì)胞模型建立成功。CMP對(duì)α-MSH誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)黑色素含量及酪氨酸酶活性均呈現(xiàn)出明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。與陽性對(duì)照熊果苷相比較，CMP對(duì)黑色素含量及酪氨酸酶活性的抑制作用更明顯，表明桑白皮多酚的美白效果優(yōu)于已被普遍認(rèn)可的美白添加劑熊果苷。

本研究還進(jìn)一步探討了CMP抑制黑色素生成的作用機(jī)制，分別采用Western blot和qRT-PCR測(cè)定B16細(xì)胞中TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)。研究表明[15]，黑色素的生物合成含量與速度由TYR、TRP-1、TRP-2 3種黑色素細(xì)胞特異酶催化，其中TYR、TRP-1、TRP-2的異常表達(dá)會(huì)引起黑色素的大量生成，從而導(dǎo)致多種色素性皮膚病的發(fā)生，如皮膚斑點(diǎn)、白癜風(fēng)、惡性黑色素瘤等。MITF是黑色素生成通路中另一個(gè)重要調(diào)控基因，MITF可以上調(diào)TYR基因的表達(dá)，從而促進(jìn)黑色素的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，CMP能夠明顯下調(diào)α-MSH誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA和蛋白表達(dá)水平。CMP可能通過抑制MITF基因的表達(dá)，下調(diào)了TYR、TRP-1、TRP-2的基因水平，進(jìn)而抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素的生成。

Fig 3 Effect of CMP on α-MSH induced TYR, TRP-1, TRP-2, MITF protein levels in B16 cells n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

綜上所述，本研究揭示了CMP能夠明顯抑制α-MSH誘導(dǎo)黑色素的生成，其機(jī)制可能是通過調(diào)控TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制酪氨酸酶活性實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果有望為CMP在化妝品或藥品的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在安徽省黃山學(xué)院生態(tài)與健康技術(shù)中心和韓國(guó)安東國(guó)立大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝胡長(zhǎng)玉、萬志兵老師、郭孝成、盧瑋瑋、戴毅等同學(xué)的幫助，在此致以真誠(chéng)的感謝。)