李未祥，周大臣，王 石，崔 笑，侯 輝，耿小平

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，安徽 合肥 230601)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]，對(duì)于HCC的治療，目前仍首選手術(shù)，但分子靶向治療逐漸成為熱點(diǎn)。核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞凋亡、病毒復(fù)制、腫瘤發(fā)生、炎癥和各種自身免疫疾病的調(diào)節(jié)中起至關(guān)重要的作用，文獻(xiàn)報(bào)道其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用[2-4]。Caspase募集域和膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白3(CARD recruited membrane associated protein 3，CARMA3)蛋白是NF-κB上游調(diào)節(jié)因子[5-7]。七葉皂苷鈉(sodium aescinate, SA)是一種天然植物提取物，于2006年2月被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準(zhǔn)為臨床用藥，主要用于抗氧化、抗炎和保護(hù)血管損傷，相關(guān)研究證實(shí)七葉皂苷鈉能防止炎癥引起的肝損傷[8]。且NF-κB信號(hào)通路與氧化和炎癥相關(guān)[9]，所以我們假設(shè)，通過(guò)干擾CARMA3/NF-κB信號(hào)通路，七葉皂苷鈉可能有效抑制HCC的增殖。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1患者和標(biāo)本 本研究已獲得安徽醫(yī)科大學(xué)第一及第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。從我們的HCC組織庫(kù)中選取2000～2015年期間100例HCC患者的原發(fā)性肝癌腫瘤組織和相鄰肝組織。術(shù)前抗腫瘤治療或由CT、MRI或PET證實(shí)肝外轉(zhuǎn)移的患者被排除在本研究之外。所有患者均接受R0肝切除術(shù)。通過(guò)Edmondson分級(jí)系統(tǒng)表征分化和腫瘤分級(jí)。年齡、性別、肝硬化、腫瘤直徑、微血管浸潤(rùn)、腫瘤分化情況等見(jiàn)Tab 1。每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪，血清AFP、肝功能檢查、HBV-DNA和肝臟超聲檢查結(jié)果均記錄在案。隨訪的最后期限為2017年6月30日?？偵鏁r(shí)間是從首次手術(shù)到患者死亡日期或最后一次隨訪測(cè)量的。

1.1.2試劑 七葉皂苷鈉 (中國(guó)武漢化工生物化學(xué)股份有限公司,純度98%)；超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(pv9001,北京中杉金橋公司)；兔抗CARMA3多克隆抗體(ab36839，美國(guó)Abcam公司)；兔抗NF-κB(p65)單克隆抗體(D14E12，美國(guó)CST公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (美國(guó)Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):556547, 美國(guó)BD公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)碧云天公司)。

1.1.3儀器 KHB(ST-360)酶標(biāo)儀(中國(guó)上海)，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter 公司)。

1.2方法

Tab 1 Correlation between CARMA3 expression and clinical characteristics of HCC patients

1.2.1組織微陣列免疫組化 手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。組織微陣列(TMA)由Ai-We-Er公司(中國(guó)武漢)制造。每個(gè)TMA 排列25對(duì)組織，切片4 μm厚，2 mm大小。使用超敏二步法進(jìn)行免疫組化染色。將切片在二甲苯中脫石蠟，用梯度無(wú)水乙醇脫水，然后在0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，在壓力鍋中煮沸3 min。用0.3%過(guò)氧化氫以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物活性，并將切片與正常山羊血清溶液在室溫下孵育1 h以減少非特異性結(jié)合。將一抗(CARMA3 1 ∶50稀釋，NF-κB 1 ∶200稀釋)在4℃孵育過(guò)夜。次日二抗在室溫下孵育1 h。

1.2.2細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B和正常肝細(xì)胞系HL-02均獲自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(www.cellbank.org.cn)。細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每3 d更新培養(yǎng)基。

1.2.3MTT檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，以10、20、30、40 μmol·L-1的七葉皂苷鈉分別處理24、48、72 h。對(duì)照組與治療組給予相同量的溶劑(DMSO)。然后，向每個(gè)孔中加入10 μL MTT溶液(2.5 g·L-1)，將細(xì)胞在37℃下孵育4 h。加入150 μL DMSO，以溶解所得的晶體。使用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)OD值。使用以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/ OD對(duì)照組)×100%。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后用七葉皂苷鈉處理48 h，胰蛋白酶消化，預(yù)冷PBS洗滌2次后，用100 μL緩沖液(1×108·L-1)重懸后，轉(zhuǎn)移到5 mL培養(yǎng)管中，然后加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI，避光反應(yīng)15 min，最后加入400 μL緩沖液至管中，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5Western blot 將細(xì)胞在RIPA裂解液中冰浴裂解30 min，4℃、15 000 r·min-1離心20 min。將上清液保存在-80℃。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將等量的蛋白質(zhì)加載到10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5% BSA室溫下封閉1 h，抗體CARMA3(1 ∶100)和NF-κB(1 ∶1 000)在4℃孵育過(guò)夜。與二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h。ECL試劑盒顯色，Image J圖像處理系統(tǒng)分析Western blot灰度值。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0版軟件進(jìn)行分析，臨床基線資料和蛋白表達(dá)量相關(guān)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法。Kaplan-Meier檢驗(yàn)用于生存數(shù)據(jù)分析，log-rank cox用于差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1CARMA3在人肝癌組織中過(guò)表達(dá)且與臨床病理、腫瘤直徑、TNM分期及預(yù)后相關(guān)患者基本特征見(jiàn)Tab 1。TMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(Fig 1)，CARMA3主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與57例(57%)HCC患者相比，相同患者的相鄰肝組織相對(duì)較高。 CARMA3在低分化和TNM惡性分期高的組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的正常組織(P=0.004，P=0.008)。在腫瘤直徑大于5 cm的亞組中，腫瘤組織中CARMA3的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。然而，性別、年齡、HBV、AFP水平、Child-Pugh、肝硬化、腫瘤數(shù)目和微血管浸潤(rùn)亞組CARMA3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 1)。在100例患者中，93例患者完全隨訪記錄，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組兩組。Kaplan-Meier曲線表明，CARMA3或NF-κB過(guò)表達(dá)患者總體生存期、總體存活率低于CARMA3或NF-κB低表達(dá)者(Fig 1B)。結(jié)果表明，CARMA3和NF-κB的過(guò)表達(dá)與總生存期明顯相關(guān)(P=0.027，P=0.005)，且CARMA3的表達(dá)程度明顯與NF-κB表達(dá)程度相關(guān)(P<0.01)。

2.2七葉皂苷鈉抑制HCC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡七葉皂苷鈉處理72 h后能明顯抑制HepG2和Hep3B細(xì)胞株的增殖(IC50=46 μmol·L-1)。然而，七葉皂苷鈉對(duì)HL-02細(xì)胞系的增殖幾乎無(wú)影響。此外，七葉皂苷鈉的抑制作用呈時(shí)間和劑量依 賴性(Fig 2)。Fig 3流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，七葉皂苷鈉能夠有效促進(jìn)HepG2和Hep3B細(xì)胞系的凋亡。

Fig 1 Expression of CARMA3/NF-κB in hepatocellular carcinoma and adjacent paracancerous tissues and its correlation with prognosis

A:Expression of CARMA3 and NF-κB in HCC tissues was higher than that in paracancerous tissues; B:The patients with low CARMA3 and NF-κB expression had long overall survival time.

Fig 2 Effect of sodium aescinate on HCC cell lines and normal liver cell HL-02

A: Effect of sodium aescinate on three cell lines for 48 h; B: Effect on HepG2 of sodium aescinate was stronger with the concentration increase and time-dependent; C: Effect on Hep3B of sodium aescinate was stronger in a concentration- and time-dependent manner.**P<0.01vs24 h

Fig 3 Apoptosis of three cell lines at a concentration of 40μmol·L-1

A:The number of early apoptosis of SA-treated tumor cells was higher than that of the control group and not obvious in normal cells from the flow cytometry; B: The early apoptotic rate of SA-treated tumor cells was significantly higher than that of the control group, but no effect was detected on normal liver cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.3七葉皂苷鈉下調(diào)肝癌細(xì)胞株CARMA3和NF-κB的表達(dá)40 μmol·L-1七葉皂苷鈉處理肝癌細(xì)胞48 h后，F(xiàn)ig 4A免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CARMA3的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中，而NF-κB主要在細(xì)胞核中表達(dá)，和免疫組化結(jié)果一致，且七葉皂苷鈉抑制HCC細(xì)胞中CARMA3和NF-κB的表達(dá)。Fig 4B Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)七葉皂苷鈉可下調(diào)CARMA3和NF-κB表達(dá)(P<0.05)。

3 討論

七葉皂苷鈉是一種天然植物提取物，因其在抗炎、抗氧化方面取得良好療效，被批準(zhǔn)用于臨床，但其抗腫瘤作用研究報(bào)道較少。齊世美等[10]報(bào)道，七葉皂苷鈉能通過(guò)抑制Akt、ERK上游信號(hào)Src活性，誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，但其在抗肝癌中的作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。CARMA3蛋白與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，如腎癌、結(jié)腸癌、肺癌[11-14]，但在肝癌中的報(bào)道很少。在本研究中，我們使用TMA分析評(píng)估了HCC患者組織中CARMA3的表達(dá)及其臨床相關(guān)性。體外研究結(jié)果表明，七葉皂苷鈉通過(guò)抑制CARMA3/NF-κB信號(hào)通路，抑制肝癌細(xì)胞系的增殖并促進(jìn)其凋亡，但對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)影響。

CARMA3在肝癌組織中的TMA染色結(jié)果顯示，在低分化的HCC組織或腫瘤直徑大于5 cm的腫瘤中CARMA3的表達(dá)較高，且表達(dá)程度與患者的總生存期呈正相關(guān)，CARMA3表達(dá)程度低的患者傾向更長(zhǎng)的術(shù)后生存時(shí)間。本研究結(jié)果表明，CARMA3的表達(dá)程度與HCC組織中NF-κB的表達(dá)明顯相關(guān)，更進(jìn)一步證明CARMA3是NF-κB的上游調(diào)節(jié)因子，揭示CARMA3/NF-κB信號(hào)通路在肝癌患者中處于激活狀態(tài)。體外研究發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷鈉抑制HCC細(xì)胞株的增殖并誘導(dǎo)其早期凋亡，細(xì)胞免疫熒光和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，七葉皂苷鈉通過(guò)抑制CARMA3/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷鈉在相同濃度下，對(duì)正常 肝細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性作用。眾所周知，HCC的化學(xué)療法不盡人意，且對(duì)于治療HCC的藥物總是在Ⅲ期試驗(yàn)中失??；雖然索拉非尼被批準(zhǔn)為HCC的一線分子靶向藥物；然而索拉菲尼由于成本高，對(duì)患者有副作用，很難普及，且索拉非尼的耐藥性也是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，迫切需要找到一種有效和經(jīng)濟(jì)的藥物。本研究結(jié)果顯示，七葉皂苷鈉滿足這些條件，在治療HCC中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)CARMA3在肝癌組織中過(guò)表達(dá)，與HCC患者的預(yù)后相關(guān)，且七葉皂苷鈉通過(guò)抑制CARMA3/NF-κB信號(hào)通路，能有效抑制人肝癌細(xì)胞的增殖。

A: Immunofluorescence was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB in cells; B: Western blot was used to detect the expression of CARMA3 and NF-κB; C: CARMA3 and NF-κB gray value ratio.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.