常 萍，徐 艷，周大宇，吳笳迪，馬世良

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)1. 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、2. 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

近年來，乳腺癌的發(fā)生率和死亡率都明顯上升。目前醫(yī)學(xué)多采用藥物化療，但副作用強(qiáng)、治愈率低、復(fù)發(fā)快，嚴(yán)重影響著乳腺癌的治療效果。隨著細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在腫瘤研究中的深入，從天然物質(zhì)中提取的活性成分在腫瘤治療中具有療效好、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，受到研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。銀杏作為珍貴的藥用資源，其葉、果和外種皮都廣泛應(yīng)用于生物制藥行業(yè)。銀杏多糖是從銀杏葉、果和外種皮中提取的活性物質(zhì)，被證實(shí)在調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤增殖、抗過敏、降血脂、放化療輔助等方面發(fā)揮作用。Yan等[1]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉多糖通過激活促凋亡蛋白Bax，引起線粒體內(nèi)Cyt C的釋放，啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Lee等[2]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮多糖通過下調(diào)突變型p53基因的表達(dá)，引起線粒體中Cyt C的釋放和胞質(zhì)中ATP的釋放，激活caspase-9，裂解下游效應(yīng)蛋白酶caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。雖然，銀杏多糖類化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制已有報(bào)道，但關(guān)于多糖類化合物在腫瘤細(xì)胞能量代謝機(jī)制方面的研究還未見報(bào)道。本研究以小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，通過研究銀杏多糖對細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，分析其對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporters, GLUTs)家族基因表達(dá)的影響，從體外實(shí)驗(yàn)的角度探討銀杏多糖在乳腺癌能量代謝中的干預(yù)作用，為后期研究提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞為綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.2藥物與試劑成熟期銀杏葉、外種皮和白果均采集于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，經(jīng)鑒定為銀杏科銀杏屬植物GinkgobilobaL.，于陰涼干燥處晾干，打粉，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。胎牛血清、青霉素、鏈霉素?.25%-EDTA胰蛋白酶、RPMI 1640培養(yǎng)液，均購自Hyclone公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒、DAPI溶液、Quantitative Real-time PCR Kit，購自北京索萊寶公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol試劑，購自Thermo Scientific公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Bio-Rad公司)；CO2培養(yǎng)箱、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、臺(tái)式低溫離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Lightcycle公司)。

1.4方法

1.4.1銀杏多糖的制備及含量測定 參照許愛華等[3]發(fā)表專利的方法(專利號：CN201010251050.9)制備銀杏多糖，之后采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。依據(jù)葡萄糖做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：吸光值A(chǔ)=12.092c-0.103 5，R2=0.999。其中A為吸光度值，c為溶液濃度，計(jì)算提取物中銀杏多糖濃度，從而得出溶解的多糖凍干粉中多糖含量，多糖含量與原料總重量之比即為多糖得率。

1.4.2小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 4T1細(xì)胞用含有10% FBS、100 mg·L-1鏈霉素和1×105U·L-1青霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，每1～2 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后第4～6代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3實(shí)驗(yàn)分組 將4T1細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組用不同濃度銀杏多糖(100、200、400、600、800 mg·L-1)處理，對照組用相同體積培養(yǎng)基處理。

1.4.4顯微鏡下觀察多糖對細(xì)胞形態(tài)的影響 將銀杏多糖處理的4T1細(xì)胞培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察多糖處理后4T1細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4.5臺(tái)盼藍(lán)拒染法 4T1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS漂洗細(xì)胞1～2次，臺(tái)盼藍(lán)染色,鏡檢。利用Image-Pro Plus分析軟件檢測存活細(xì)胞數(shù)，并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(1-多糖處理組死細(xì)胞數(shù)/多糖處理組細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.6MTT法 在4T1細(xì)胞結(jié)束培養(yǎng)前4 h更換新培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，低速震蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測其在490 nm波長下的吸光度。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞抑制率/%=(1-多糖處理組OD值/對照組OD值)×100%，利用SPSS軟件計(jì)算銀杏多糖的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)，據(jù)此確定接下來銀杏多糖作用細(xì)胞的濃度。

1.4.7DAPI核染色 將多糖處理的4T1細(xì)胞進(jìn)行DAPI核染色，于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照，利用Image-Pro Plus分析軟件檢測凋亡細(xì)胞數(shù)，并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率/%=(多糖處理組凋亡細(xì)胞數(shù)/多糖處理組總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.8銀杏多糖對4T1細(xì)胞GLUT家族基因表達(dá)的分析 采用qRT-PCR法檢測經(jīng)銀杏葉和銀杏外種皮多糖培養(yǎng)48 h的4T1細(xì)胞GLUT家族基因mRNA表達(dá)情況。內(nèi)參β-actin基因上游引物序列為：5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物序列為：5′-GGAAAAGAGCCTCAGGGCAT-3′，GLUT家族基因上下游引物序列見Tab 1，引物由金唯智生物公司合成。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR檢測。得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt計(jì)算多糖處理后的GLUT家族基因mRNA的相對表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1銀杏多糖的含量和得率分析依據(jù)490 nm下測定的銀杏多糖吸光度和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得出銀杏葉、外種皮和白果多糖濃度分別為160.3 mg·L-1、230.8 mg·L-1、60.2 mg·L-1，得到的總多糖化合物質(zhì)量分別為0.57g、0.68g、0.30 g，總多糖得率分別為1.14%、1.36%、0.06%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀杏多糖以外種皮中含量最高，白果中含量最低。

2.2銀杏多糖對4T1細(xì)胞形態(tài)改變的影響不同劑量銀杏多糖處理4T1細(xì)胞48 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。如Fig 1所示，對照組細(xì)胞生長良好，形態(tài)均一，排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，呈典型的上皮樣貼壁生長。銀杏白果多糖處理組細(xì)胞形態(tài)與對照組相比無明顯變化。隨著藥物劑量的增大，銀杏葉和銀杏外種皮多糖處理組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，梭形細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞呈聚集性生長，形狀不規(guī)則，細(xì)胞間黏附作用增強(qiáng)，細(xì)胞膜表面有發(fā)泡現(xiàn)象，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。當(dāng)銀杏葉多糖劑量和銀杏外種皮多糖劑量分別達(dá)到400 mg·L-1和600 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞黏附現(xiàn)象逐漸消失，細(xì)胞萎縮、體積減小。

2.3各處理組細(xì)胞存活率比較如Fig 2所示，4T1細(xì)胞經(jīng)不同劑量銀杏白果多糖作用48 h，細(xì)胞存活率最小為(92.26±0.51)%，與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)銀杏葉多糖劑量不超過200 mg·L-1、銀杏外種皮多糖劑量不超過400 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率最小為(72.68±2.69)%，死細(xì)胞數(shù)雖高于對照組，但差異無顯著性，說明在一定劑量范圍內(nèi)，銀杏多糖抑制細(xì)胞不是直接的細(xì)胞毒作用。當(dāng)二者多糖劑量達(dá)到800 mg·L-1，細(xì)胞存活率分別減少至(12.29±0.34)%、(14.58±0.59)%，與對照組相比，均有極顯著差異(P<0.01)。提示隨著多糖劑量不斷地增大，對細(xì)胞的毒性作用也隨之增強(qiáng)。

Tab 1 Primer sequence synthesis of GLUT family

Fig 1 Cell morphology of 4T1 breast cancer cells treated with different concentrationsof polysaccharides from Ginkgo biloba for 48h under light microscope

A:Different concentrations of Ginkgo biloba leaf polysaccharide treated 4T1 cells for 48 h; B: Different concentrations of Ginkgo biloba exocarp polysaccharide treated 4T1 cells for 48 h; C: Different concentrations of Ginkgo biloba seed polysaccharide treated 4T1 cells for 48 h. Red arrows represent the aggregation cells.

Fig 2 Effects of different concentrations of polysaccharidesfrom Ginkgo biloba on cell

**P<0.01vscontrol

2.4各處理組細(xì)胞抑制率比較如Fig 3所示，4T1細(xì)胞經(jīng)不同劑量銀杏白果多糖作用48 h后，細(xì)胞抑制率最大為(5.23±0.26)%，與對照組相比細(xì)胞活力無明顯變化。銀杏葉和銀杏外種皮多糖處理組細(xì)胞增殖明顯受劑量依賴性抑制。4T1細(xì)胞分別經(jīng)800 mg·L-1銀杏葉和銀杏外種皮多糖作用48 h，抑制率分別為(69.24±2.14)%、(59.08±3.56)%，與對照組相比差異均具有顯著性(P<0.01)，其作用4T1細(xì)胞48 h的IC50分別為196.423 mg·L-1和484.231 mg·L-1。由Fig 4可見，銀杏葉和銀杏外種皮多糖對4T1細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間依賴性。結(jié)果提示，銀杏葉和銀杏外種皮多糖能有效抑制4T1細(xì)胞的增殖。

Fig 3 Effects of different concentrations of polysaccharides fromGinkgo biloba on proliferation of 4T1 cells for 48

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 4 Inhibition of proliferation of 4T1 cells from differentGinkgo biloba polysaccharides at different

**P<0.01vscontrol

2.5銀杏多糖對4T1細(xì)胞凋亡的影響Fig 5的DAPI染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞核呈圓形，淡藍(lán)色，染色均勻，而經(jīng)銀杏葉和銀杏外種皮多糖處理后的細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的凋亡特征，可見凋亡的細(xì)胞由于細(xì)胞核固縮，核碎裂，染色質(zhì)凝聚，并呈新月形凝聚于核膜一邊，銀杏白果多糖處理組細(xì)胞形態(tài)與對照組相比并無明顯改變。Fig 6結(jié)果顯示，4T1細(xì)胞經(jīng)不同劑量銀杏白果多糖作用48 h，細(xì)胞凋亡率最大為(6.83±0.57)%，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。銀杏葉和銀杏外種皮多糖處理組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，當(dāng)二者劑量達(dá)到800 mg·L-1，細(xì)胞凋亡率分別增加至(58.26±2.83)%、(54.38±1.82)%與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明銀杏葉和銀杏外種皮多糖處理后呈劑量依賴性促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.6銀杏多糖對4T1細(xì)胞GLUT家族基因mRNA表達(dá)的影響通過qRT- PCR法分析了銀杏葉多糖(IC50)及銀杏外種皮多糖(IC50)分別作用4T1細(xì)胞48 h后，GLUT家族基因mRNA表達(dá)情況。如Fig 7所示，與對照組相比，銀杏葉多糖處理后，GLUT1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，GLUT7 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；銀杏外種皮多糖處理后，GLUT1 mRNA表達(dá)水平也明顯降低(P<0.01)，GLUT12 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。提示銀杏葉和銀杏外種皮多糖能不同程度地影響GLUT家族基因的表達(dá)。

Fig 5 The cell nuclear morphology of mouse breast cancer 4T1 cells treated with different concentrationsof polysaccharides from Ginkgo biloba for 48 h under fluorescent microscope

A: Different concentrations of Ginkgo biloba leaf polysaccharide treated 4T1 cells for 48 h; B: Different concentrations of Ginkgo biloba exocarp polysaccharide treated 4T1 cells for 48 h; C: Different concentrations of Ginkgo biloba seed polysaccharide treated 4T1 cells for 48 h. Red arrows indicate apoptotic cells; white arrows represent normal cells.

Fig 6 Effects of different concentrations of polysaccharidesfrom Ginkgo biloba on apoptosis of 4T1

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

研究表明，銀杏提取物的抗腫瘤活性機(jī)制表現(xiàn)為多方面的，主要包括線粒體凋亡機(jī)制、細(xì)胞周期阻滯機(jī)制、死亡信號調(diào)節(jié)機(jī)制、活性物質(zhì)-配體相互作用機(jī)制等，其中研究比較多的是細(xì)胞凋亡機(jī)制。Cao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮提取物能抑制小鼠肺癌荷瘤的生長，促進(jìn)Bax-2/Bcl-2跨線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)引起的Cyt C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏提取物EGb761通過增強(qiáng)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞caspase-3的活性、降低Bcl-2表達(dá)和上調(diào)p53 mRNA表達(dá)，呈劑量依賴性地抑制細(xì)胞增殖。Dias等[6]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg·kg-1銀杏葉提取物與他莫昔芬(TAM)聯(lián)合用藥，通過增強(qiáng)♀SD大鼠乳腺腫瘤細(xì)胞caspase-3的活性、降低Bcl-2表達(dá)，提高p53 mRNA表達(dá)，從而抑制乳腺腫瘤的生長。Bai等[7]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏提取物通過激活細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-3，提高p53和Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞停留在G0/G1期，阻滯細(xì)胞進(jìn)入分裂期，抑制腫瘤的生長。此外，銀杏提取物提高caspase-3蛋白表達(dá)，同時(shí)引起Fas凋亡信號傳導(dǎo)通路中Fas、FasL、p38 mRNA和蛋白表達(dá)增加，降低p-ERK1/2和p-JNK1/2 蛋白表達(dá)水平。該研究結(jié)果提示，銀杏提取物通過內(nèi)源性線粒體途徑、外源性死亡受體途徑和促分裂素原活化蛋白激酶途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

銀杏多糖是銀杏中分離得到的活性成分之一，具有多種生物學(xué)功能。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，500 mg·L-1銀杏葉多糖體外作用SMMC-7721細(xì)胞36 h，能夠明顯抑制細(xì)胞增殖。Xu等[9]在胃癌患者口服銀杏外種皮多糖制劑膠囊的臨床研究和增殖凋亡檢測中發(fā)現(xiàn)，銀杏外種皮多糖可能通過降低c-myc、Bcl-2，提高c-fos基因表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分化。Chen等[10]在研究銀杏葉多糖對人膀胱癌T24細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，多糖可能通過激活caspase-9，裂解下游效應(yīng)蛋白酶caspase-3，增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，引起線粒體膜電位缺失，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，對銀杏白果多糖的研究多集中在結(jié)構(gòu)和功能特性兩方面，大量研究結(jié)果表明銀杏白果多糖能明顯提高小鼠血清和肝臟中蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶含量，降低丙二醛含量，增強(qiáng)小鼠抗氧化能力，對其抑制腫瘤機(jī)制及參與信號通路的研究鮮有報(bào)道。

Fig 7 Effects of different polysaccharides from Ginkgo biloba on mRNA levels of GLUT

腫瘤細(xì)胞能量代謝異常是其不同于正常細(xì)胞的主要原因，通過阻斷腫瘤細(xì)胞糖代謝途徑，抑制細(xì)胞增殖是癌癥治療的關(guān)鍵[11]。GLUTs作為一類重要的載體蛋白，在腫瘤細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明，GLUT1在肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，使得GLUT1常常被作為檢測早期癌變的標(biāo)志[12]。Yan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人胃癌細(xì)胞通過攝取更多的葡萄糖，引起GLUT1異常高表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Ma等[14]研究抑制因子N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc down-stream regulated gene family, NDRG2)在腫瘤葡萄糖代謝中作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，NDRG2表達(dá)與乳腺癌組織中的GLUT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2能夠通過促進(jìn)GLUT1的降解，抑制葡萄糖攝取，從而干預(yù)乳腺癌細(xì)胞能量代謝。Schwartzenberg-Bar-Yoseph等[15]在研究p53和GLUT1之間的表達(dá)關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生型p53以組織特異性的方式抑制GLUT1基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞的能源供應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏多糖作用后明顯抑制4T1細(xì)胞增殖，引起GLUT1基因表達(dá)水平下降，提示銀杏多糖可能通過降低GLUT1基因的表達(dá)，干預(yù)腫瘤細(xì)胞的能量代謝，抑制4T1細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，銀杏葉多糖可以明顯下調(diào)GLUT1基因的表達(dá)，上調(diào)GLUT7基因的表達(dá)；銀杏外種皮多糖可以明顯下調(diào)GLUT1和GLUT12基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，GLUT1是研究最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與了復(fù)雜的信號通路，通過多種因子的調(diào)節(jié)發(fā)揮生物學(xué)功能；GLUT7是已知的果糖轉(zhuǎn)運(yùn)體；GLUT12是已知的能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞葡萄糖水平的轉(zhuǎn)運(yùn)體。但GLUT7和GLUT12調(diào)控機(jī)體糖代謝水平具體機(jī)制還未見報(bào)道，參與調(diào)控的信號通路尚不明確。本項(xiàng)研究結(jié)果表明，銀杏多糖直接或間接地參與了GLUT1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，銀杏葉和銀杏外種皮多糖能夠抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能從轉(zhuǎn)錄水平上影響GLUT1基因的表達(dá)，干預(yù)腫瘤細(xì)胞能量代謝，這些初步研究為銀杏多糖類天然活性物質(zhì)的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為明確銀杏多糖抗腫瘤作用機(jī)制的研究和癌癥的靶向治療提供了參考。本研究后續(xù)工作已經(jīng)取得一定進(jìn)展，對GLUT家族基因啟動(dòng)子活性研究及功能分析，進(jìn)一步研究銀杏多糖對GLUT家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)調(diào)控作用，為后期銀杏多糖靶向阻斷腫瘤細(xì)胞糖代謝途徑和調(diào)控相關(guān)信號分子通路研究提供了參考。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝給予本課題幫助的老師和同學(xué)！)