周凡莉，黃 林，金素鈺，鄭玉才

(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041)

動物基因組DNA提取方法包括十二烷基磺酸鈉(SDS)法、酚-氯仿抽提法、堿裂解法、試劑盒提取法等[1].其中酚-氯仿抽提取法實驗過程復雜、耗時，容易產(chǎn)生交叉污染，使用有害試劑；而試劑盒法操作過程較多，大規(guī)模使用成本較高；Chelex-100法近年來被廣泛使用，適應于微量樣品提取DNA[2-3].Chelex-100樹脂可去除樣品和緩沖液中的金屬離子，防止DNA降解，操作簡便，已用于血液、乳、蚊蟲附肢、眼角膜、肝臟和肌肉、口腔黏膜細胞等生物材料提取基因組DNA[4-9].

用Chelex-100法提取DNA的全部過程在同一個EP管中進行，污染機會少，檢材損失小，適用于微量生物樣品的DNA提取，雖然提取的DNA純度不高，但作為PCR反應模板制備方法具有很大的優(yōu)勢[10].肌肉組織是常見的實驗材料.本研究嘗試建立用Chelex-100法快速提取牦牛肌肉中基因組DNA，以便為開展大規(guī)模的分子遺傳學研究提供材料.

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

九龍牦牛背最長肌采自四川省甘孜州的九龍縣.在冬季牦牛屠宰時，采集背最長肌，迅速冰凍后用冰瓶帶回實驗室，-80℃保存至分析.樣品分析時已經(jīng)在該條件下保存長達9年.本研究取10個背最長肌樣品進行試驗.

1.2 肉中基因組DNA的提取

參考Amills等提取乳樣DNA的方法[11]提取肌肉中基因組DNA.主要步驟如下：1.5 mL的EP管中加入100 μL 的 5%Chelex-100和2 μL 的 20 mg/mL 新鮮蛋白酶K，加入肌肉組織，渦旋10 s；56℃金屬浴孵育30 min；保溫結(jié)束后于100℃沸水浴變性8 min，迅速置于冰上冷卻3 min；渦旋10 s，8000 g離心1 min，上清液分裝備用，-20℃保存.

本研究中試驗的肌肉保持冰凍狀態(tài)，采取兩種方法取樣.方法一(鑷子取樣)：用干凈的鑷子，迅速取小米粒大小的肌肉；方法二(槍頭取樣)：采用傾斜修剪的200 μL槍頭，迅速插取肌肉，該方法在槍頭上并未見明顯的肌肉組織.

1.3 PCR引物的設(shè)計

用PCR擴增核基因和線粒體基因.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中普通牛的Prdm 9(登錄號：KJ020105)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計Prdm 9基因的PCR引物.擴增牦牛Cytb和CSN2基因分別參考胡強等[12]和McLachlan[13]研究中的引物.3個基因的引物序列和預期擴增長度等信息見表1.引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成.

表1 PCR引物信息Table 1 The information of PCR primers

1.4 PCR擴增與檢測

Prdm9、Cytb和CSN2基因的PCR擴增反應體系(25.5 μL)：金牌Mix(Green)22 μL，DNA 模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL.PCR擴增條件：98℃預變性3 min；98 ℃變性30 s；退火(溫度見表1)30 s；72 ℃延伸(3個基因依次為40 s、15 s、10 s)，共計35個循環(huán)；72℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5 PCR產(chǎn)物的測序與分析

為驗證PCR產(chǎn)物可用于后續(xù)研究，將Cytb基因的PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司進行正向測序，利用DNAman軟件與普通牛(登錄號：AY885283)和普通牦牛(登錄號：KM280686)序列進行比對.

2 結(jié)果

2.1 鑷子取樣提取肉中基因組DNA的PCR擴增

牦牛肌肉樣品用鑷子取樣后提取基因組DNA，PCR擴增CSN2、Cytb和Prdm9基因，發(fā)現(xiàn)3個基因的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上均顯示出單一的清晰條帶，分子量大小與預期片段大小吻合(圖1).3個基因的擴增效果均存在樣品個體差異，如牦牛Cytb基因擴增產(chǎn)物的電泳條帶的亮度存在較明顯的個體差異(圖2).

2.2 槍頭取樣提取肉中基因組DNA的PCR擴增

牦牛肌肉樣品用槍頭取樣后提取基因組DNA，PCR擴增Cytb基因，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上均顯示出單一的清晰條帶，分子量大小與預期片段大小吻合.PCR循環(huán)數(shù)與擴增效果有關(guān)，大部分樣品PCR擴增35個循環(huán)的產(chǎn)物可用于直接測序(圖3).

圖1 九龍牦牛CSN2、Cytb和Prdm9基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1-3：CSN2、Cytb和 Prdm9 基因；M：DNA Marker 2000.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of CSN2，Cytb and Prdm9 genes of Jiulong yak

圖2 九龍牦牛Cytb基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳1-7：Cytb基因；M：DNA Marker2000.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of Cytb gene of Jiulong yak

圖3 九龍牦牛Cytb基因不同循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳1-3：45 個循環(huán)；4-6：35 個循環(huán)；M：DNA Marker 2000.Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of Cytb gene in Jiulong yak with different cycles

2.3 PCR擴增產(chǎn)物的直接測序

對九龍牦牛Cytb基因的PCR產(chǎn)物進行正向測序，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的普通牦牛(登錄號：KM280686)、普通牛(登錄號：AY885283)序列進行比對，發(fā)現(xiàn)九龍牦牛與普通牛的序列存在差異，但與普通牦牛的序列高度一致(圖4).說明用Chelex-100法提取的牦牛肌肉中基因組DNA，PCR擴增的產(chǎn)物可直接測序，并獲得正確的序列.

圖4 九龍牦牛、普通牦牛和普通牛的Cytb基因序列信息比對Fig.4 Sequence alignments of Cytb gene of Jiulong yak，yak and cattle

3 討論

近年來Chelex樹脂越來越多地應用于提取動物基因組DNA，國內(nèi)外均有不少報道[3，14].Algriw等研究表明，Chelex-100和試劑盒均適用于提取肝臟和肌肉基因組DNA，且Chelex-100方法提取的產(chǎn)量更高.Chelex-100法是一種廉價、快速、有效的提取DNA的技術(shù)[11]，本試驗用該方法提取肌肉中的基因組DNA，整個過程只需要約30 min，而Cytb基因的PCR產(chǎn)物序列與普通牦牛、普通牛序列信息比對(圖4)，證明了Chelex-100法提取的基因組DNA的完整性，說明該方法適用于快速提取肌肉組織的DNA，并且對后續(xù)實驗無影響.

提取肌肉等組織DNA時，一般先定量取樣并勻漿，再進行后續(xù)提取實驗[15].這種方式用于大規(guī)模提取DNA時，工作量大且費時長.大規(guī)模提取肌肉組織DNA時，用鑷子取樣工作量大，增加交叉污染的可能.本研究采用的槍頭取樣簡單易行，無交叉污染，適用于大規(guī)模取樣，并且是在樣品冰凍條件下進行.本研究比較了冰凍肌肉樣品的兩種取樣方法，擴增2個核基因和1個線粒體基因，產(chǎn)物長度約300 bp～900 bp，均獲得了正確的結(jié)果.不足之處在于兩種取樣方法均無法準確定量，尤其是槍頭取樣更難以控制取樣量，這導致PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度有個體差異.

對于沒有準確稱量的組織樣品，Chelex-100法提取微量的DNA作為模板進行PCR擴增，需要適當調(diào)整循環(huán)數(shù).本試驗中槍頭取樣提取的DNA作為模板進行PCR擴增時，35個循環(huán)后一些樣品擴增產(chǎn)物濃度不是特別高，可能不能用于直接測序，需要適當增加循環(huán)數(shù)，這與Amills等從乳中提取DNA進行PCR的研究結(jié)果一致[11].

本研究表明，可用修剪后的一次性槍頭對冰凍肌肉進行取樣，采用Chelex-100法快速、大規(guī)模提取牦牛肌肉中的基因組DNA，用于PCR擴增和后續(xù)的研究.