趙振利 童琳琳 鄧敏捷 董焱鵬 范國強

(河南農(nóng)業(yè)大學泡桐研究所，河南 鄭州 450002)

泡桐 (Paulowuiaspp.) 是我國重要的綠化樹種和速生用材，其適應性強、生長速度快、材質(zhì)優(yōu)良，被各地廣泛應用于樂器、家具、建筑和工藝品等方面。泡桐叢枝病 (PaWB) 是一種由植原體侵染泡桐而引起的傳染性病害，其發(fā)病率高，被感染的泡桐會出現(xiàn)腋芽叢生，葉片變小發(fā)黃，節(jié)間變短，花變?nèi)~等癥狀，嚴重時甚至導致整株死亡。這一病害嚴重影響了泡桐的生長發(fā)育，阻礙了泡桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，進行泡桐叢枝病防治方面的研究變得尤為重要。蛋白質(zhì)在植物生長發(fā)育，新陳代謝和抵抗病原體入侵等生命活動中發(fā)揮重要作用[1]。植物的生命活動過程離不開蛋白質(zhì)，分析泡桐叢枝病發(fā)生過程中的蛋白質(zhì)表達變化，有助于進一步揭示泡桐叢枝病發(fā)生機理。近年來，雖然研究人員對泡桐進行了轉錄組、miRNA和蛋白質(zhì)組等方面的研究，也鑒定到了一些與泡桐叢枝病發(fā)生的相關基因、miRNA和蛋白質(zhì)[2-4]，但是由于缺乏泡桐基因組分析背景，這些研究均是以denovo組裝轉錄組為基礎的，導致了研究結果不能系統(tǒng)反映泡桐叢枝病發(fā)生相關的調(diào)控物質(zhì)及其相互關系，且需要花費大量的時間進行后期的功能驗證，而以基因組為背景的分析，不僅可以降低計算強度，而且可以提高基因注釋的準確性。

課題組在前期研究的基礎上，進行了泡桐基因組測序研究，構建了泡桐基因組的精細圖譜，而以完整泡桐基因組為背景的組學研究在揭示泡桐叢枝病發(fā)生分子機理方面具有明顯優(yōu)勢。本研究以泡桐基因組為分析背景，使用iTRAQ技術研究泡桐樣品蛋白質(zhì)組的變化情況，通過比對分析鑒定出與泡桐叢枝病發(fā)生密切相關的蛋白質(zhì)，并應用生物信息學方法對這些蛋白質(zhì)進行功能分析，分析其在泡桐叢枝病發(fā)生中的調(diào)控作用，從而為揭示泡桐叢枝病發(fā)生的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

實驗材料取自河南農(nóng)業(yè)大學林木生物技術實驗室組織培養(yǎng)30 d的毛泡桐 (Paulowniatomentosa) 健康苗 (PT) 和對應的叢枝病苗 (PTI)。截取上述生長良好且長勢一致的叢枝病幼苗約1.5 cm長的頂芽，接種在含0、20和60 mg/L MMS (PTI, PTI-20, PTI-60) 的1/2 MS培養(yǎng)基的三角瓶 (容量100 mL) 中，將1.5 cm PT的頂芽接種到不含MMS的相同培養(yǎng)基中作為對照。每個樣品培養(yǎng)30瓶，每個三角瓶中培養(yǎng)3個外植體，實驗重復3次。所有外植體先在溫度為20 ℃暗室中培養(yǎng)5 d，然后再將外植體置于溫度為 (25 ± 2) ℃、光強為130 μmol/(m2·s)、光照時間為16 h/d的環(huán)境下培養(yǎng)25 d。培養(yǎng)完成后，分別剪取4個處理組幼苗的頂芽，快速用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，用于蛋白質(zhì)的提取。

1.2 蛋白質(zhì)提取

稱取PT、PTI、PTI-20和PTI-60四種樣品各1.0 g放入用液氮冷卻的研缽中，在液氮中迅速研磨，待研磨成粉末狀后加入適量蛋白裂解液溶解，然后再分別加入終濃度為1 mmol/L的PMSF和2 mmol/L的EDTA，根據(jù)Tang等[5]的方法提取蛋白質(zhì)。

1.3 ITRAQ標記SCX分離

為了用iTRAQ試劑標記從HP，PIP，PIP-20和PIP-60樣品獲得的肽段，分別稱取這4種樣品提取的蛋白質(zhì)100 μg，使用Meng等[6]的方法將蛋白質(zhì)消化并用iTRAQ標記。將標記后的各組肽段混合，使用UltremexSCX分離柱對樣品進行液相分離，得到的組分用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干，詳細方法參照文獻 [7]。

1.4 基于Triple TOF 5600的LC-MS/MS分析

使用LC-20AD型號的納升液相色譜儀 (Shimadzu, Kyoto, Japan) 和Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Concord, ON) 對上述得到的組分進行LC-MS/MS分析，具體過程參照文獻 [8]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Proteome Discoverer 1.2軟件 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) 將獲取的原始數(shù)據(jù)文件轉換為Mascot通用格式文件，使用Mascot 2.3.02軟件進行蛋白質(zhì)的鑒定，所使用的數(shù)據(jù)庫為泡桐全基因組數(shù)據(jù)庫。用GO數(shù)據(jù)庫對鑒定出的蛋白質(zhì)進行功能分析，并根據(jù)其生物學過程，分子功能和細胞組分對蛋白進行分類。用COG及KEGG數(shù)據(jù)庫對這些蛋白的功能進行進一步分析。當?shù)鞍踪|(zhì)的差異倍數(shù)≥1.2、且統(tǒng)計檢驗其P< 0.05時確定為不同樣品間的差異蛋白質(zhì)。

1.6 qRT-PCR驗證

為了驗證由iTRAQ鑒定的差異蛋白，隨機挑選8個差異表達的蛋白質(zhì)進行qRT-PCR驗證。采用植物總RNA抽提試劑盒(北京愛普拜生物技術有限公司)提取PT、PTI、PTI-20和PTI-60的RNA樣品。qRT-PCR反應用Taq SYBR?Green qPCR Premix試劑 (Yugong Biolabs)，在美國Bio-Rad公司的CFX96TMReal-Time System熒光定量PCR檢測系統(tǒng)上完成。PCR反應體系和擴增程序參照文獻 [9]，每個樣品3次重復。內(nèi)參18S rRNA進行校正，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用2-△△Ct法進行。引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的鑒定基本信息

為了解毛泡桐蛋白質(zhì)組的整體信息，對4個毛泡桐樣品 (PT, PTI, PTI-20和PTI-60) 中的總蛋白質(zhì)進行了iTRAQ定量分析，其中一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜精確度都小于2 mg/kg，且數(shù)據(jù)庫搜索的肽段匹配誤差控制在0.05 Da以下，鑒定基本信息統(tǒng)計見圖1。在本次質(zhì)譜實驗中總共得到了182 895個譜圖，使過Mascot軟件進行分析后，發(fā)現(xiàn)有10 044個譜圖被匹配到，其中7 564個是特有肽段的譜圖，鑒定到的蛋白質(zhì)共1 622個，肽段3 814個，特有肽段3 187個。

表1 qRT-PCR驗證差異表達蛋白的轉錄本引物序列Table 1 Primers of qRT-PCR analysis of transcripts corresponding to differentially expressed proteins

圖1 蛋白質(zhì)鑒定基本信息統(tǒng)計Fig.1 The basic information of proteome identification

2.2 蛋白質(zhì)功能注釋及分類

為了對毛泡桐蛋白質(zhì)的功能有進一步的了解，將鑒定得到的1 622個蛋白質(zhì)進行GO功能分類 (圖2)。從餅狀圖中可以看出，在生物學過程中，蛋白質(zhì)主要參與代謝過程和細胞過程，分別占29.24%和23.61%；在細胞組分中，蛋白質(zhì)主要集中在細胞和細胞組分，這兩部分均占總組分的23.14%；在分子功能中，蛋白質(zhì)功能主要體現(xiàn)在催化活性和結合方面，分別占45.72%和29.20%。通過對鑒定蛋白質(zhì)的COG分析發(fā)現(xiàn)，注釋到的蛋白質(zhì)共分23類，其中蛋白質(zhì)數(shù)量最多的是一般功能類，有358個蛋白質(zhì)，而細胞移動類最少，僅有2個蛋白質(zhì) (圖3)。通過KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，有1 300個蛋白質(zhì)參與到122個pathway中。表2中為鑒定的蛋白質(zhì)注釋到的通路數(shù)目和比例最高的20條pathway信息，其中涉及光合生物碳固定的有61個，占總量的4.36%；氧化磷酸化有44個，占總注釋蛋白質(zhì)量的3.14%；光合作用的有38個，占總注釋蛋白質(zhì)量的2.71%。

圖2 全部蛋白質(zhì)的GO分類Fig.2 GO classification of all protein

A. RNA合成和修飾; B. 染色質(zhì)結構; C. 能量生成和轉換; D. 細胞周期、細胞分裂、染色體分離; E. 氨基酸轉運和代謝; F. 核酸轉運和代謝; G. 碳水化合物轉運和代謝; H. 輔酶轉運和代謝; I. 脂質(zhì)轉運和代謝; J. 翻譯、核糖體合成; K. 轉錄; L. 復制、重組和修飾; M. 細胞壁/質(zhì)膜/囊膜合成; N. 細胞運動; O. 轉錄后修飾、蛋白轉運、分子伴侶; P. 無機離子轉運代謝; Q. 次生代謝物合成、運輸入代謝; R. 功能預測; S. 功能求知; T. 信號轉導機制; U. 胞內(nèi)運輸、分泌及液泡轉運; V. 防御機制; Z. 細胞骨架。

圖3 泡桐蛋白質(zhì)序列的COG功能分類Fig.3 COG function classification of P.tomentosa proteins表2 毛泡桐總蛋白質(zhì)的KEGG分析 (Top 20)Table 2 The KEGG analysis of P.tomentosa total proteins (Top 20)

2.3 差異蛋白質(zhì)分析

蛋白質(zhì)相對定量分析中當?shù)鞍踪|(zhì)的差異倍數(shù) ≥1.2且其P值小于0.05時，認為不同樣品間的蛋白質(zhì)存在顯著差異。研究結果表明有746個蛋白質(zhì)在PTI與PT, PTI-60與PTI-20, PTI-20與PTI和PTI-60與PT之間表達水平有顯著差異 (表3)，其中有192個蛋白質(zhì)在PTI與PT之間有顯著差異，上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為110個，下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為82個；有171個蛋白質(zhì)在PTI-60與PTI-20之間有顯著差異，上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為85個，下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為86個；有223個蛋白質(zhì)在PTI-20與PTI之間差異顯著，其中上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為88個，下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為135個；有150個蛋白質(zhì)在PTI-60與PT之間差異顯著，其中上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為74個，下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為76個。

表3 差異表達蛋白質(zhì)數(shù)量Table 3 The number of differentially abundant proteins

2.4 與泡桐叢枝病相關的差異蛋白質(zhì)分析

為了鑒別與泡桐叢枝病發(fā)生相關的差異蛋白質(zhì)，使用以前研究的比較方案[10]進行分析，其中PTI與PT比較組 (A) 中有264個差異蛋白質(zhì)與泡桐叢枝病和植物生長發(fā)育差異等因素有關，PTI-60與PTI-20比較組 (B) 中有208個差異蛋白質(zhì)與泡桐叢枝病，植物生長發(fā)育或MMS處理的差異有關。研究確定了PTI-60與PT比較組 (C) 中的1 978個非差異蛋白質(zhì)，與植物生長發(fā)育相關，PTI-20與PTI比較組 (D) 中的1 865個非差異蛋白質(zhì)與泡桐叢枝病和植物生長發(fā)育有關。最終共找到了35個可能與泡桐叢枝病相關的共同差異蛋白質(zhì) (圖4)。然后將35種差異蛋白質(zhì)的功能用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進一步分析。將35個差異蛋白質(zhì)共分配到24個GO term (圖5)，其中13個在生物過程中，包括代謝過程、細胞過程和響應刺激等；7個在細胞組分中，包括細胞、細胞部分、細胞器和細胞器組分等；4個在分子功能中，包括催化和綁定等。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與泡桐叢枝病相關的差異蛋白質(zhì)主要參與以下幾種代謝途徑相關，即光合生物碳固定、氧化磷酸化、植物病原互作、光合作用、二羧酸代謝和磷酸戊糖途徑等生物學過程。

2.5 差異表達蛋白質(zhì)的qRT-PCR驗證

為了驗證ITRAQ技術分析結果的可靠性，本研究中隨機選擇8個與泡桐叢枝病發(fā)生相關的蛋白質(zhì)進行qRT-PCR分析 (圖6)。結果顯示8個差異蛋白質(zhì)中有5個 (PAU007719.1、PAU007073.2、PAU018306.2、PAU030754.1和PAU030243.1) 轉錄水平與蛋白質(zhì)水平趨勢相一致，有3個 (PAU007585.1、PAU022001.1和PAU005810.1) 轉錄水平與蛋白質(zhì)水平表達趨勢相反，這種差異可能是由于轉錄、翻譯后加工和修飾，或不同的mRNA和蛋白質(zhì)的降解速率等因素造成的。

A. PT與PTI比較共同的差異蛋白質(zhì); B. PTI-20與PTI-60比較共同的差異蛋白質(zhì); C. PT與PTI-60比較不差異蛋白質(zhì); D. PTI與PTI-20比較不差異蛋白質(zhì)。

A1. 細胞; A2. 細胞部分; A3. 胞膜; A4. 胞外區(qū); A5. 大分子復合體; A6. 細胞器; A7. 細胞器部分; B1. 結合; B2. 催化; B3. 結構分子; B4. 轉運; C1. 解剖結構形成; C2. 生物調(diào)節(jié); C3. 細胞組分生物合成; C4. 細胞組分組織; C5. 細胞過程; C6. 發(fā)育過程; C7. 胞內(nèi)定位的建立; C8. 生長; C9. 細胞內(nèi)定位; C10. 代謝過程; C11. 涉及多個有機體的過程; C12. 涉及多細胞有機體的過程; C13. 對刺激的反應。

圖6 毛泡桐叢枝病相關蛋白對應轉錄本qRT-PCR驗證Fig.6 Quantitative RT-PCR analysis of transcripts corresponding to proteins related to P.tomentosa witches′ broom

3 結論與討論

泡桐叢枝病作為泡桐生產(chǎn)中最嚴重的病害之一，它不僅影響了泡桐的材質(zhì)和產(chǎn)量，也給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了特別大的經(jīng)濟損失，因此對泡桐叢枝病的防治變得尤為重要。由于植原體沒有細胞壁，難以進行體外培養(yǎng)，限制了對植原體與泡桐之間的互作以及泡桐叢枝病發(fā)生分子機理的研究。本實驗應用iTRAQ技術，對鑒定到的1 622個蛋白質(zhì)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)存在35個與泡桐叢枝病發(fā)生相關的差異蛋白質(zhì)，通過GO功能分類，表明這些差異蛋白主要集中在細胞、結合、催化等24個分類功能區(qū)；經(jīng)過進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白參與催化活性、苯丙烷生物合成、光合生物碳固定、光合作用和氧化磷酸化代謝等代謝通路，且對植物的生長發(fā)育有很大影響。

由于植原體基因組缺乏許多代謝途徑，使得它們不可能合成核苷酸，并且它們?nèi)狈铣葾TP的關鍵基因，需要從宿主攝入ATP[11]。因此，在被植原體感染的植物中，宿主需要為植原體生長提供能量，研究發(fā)現(xiàn)在被植原體感染的桑樹 (Morusalba) 中，宿主產(chǎn)生的能量明顯減少[12]。Oshima等[13]在研究洋蔥 (Alliumcepa) 時發(fā)現(xiàn)，植原體強烈依賴于宿主的糖酵解途徑以獲得更多的能量；而在植原體感染的墨西哥酸橙樹中，TCA循環(huán)產(chǎn)生的能量顯著增加[14]。Cao等[4]在毛泡桐的研究中發(fā)現(xiàn)ATP合成酶、卡爾文循環(huán)和糖酵解途徑在泡桐能量代謝途徑中有著至關重要的作用。本實驗在以白花泡桐基因組為背景的情況下研究發(fā)現(xiàn)，被植原體感染的毛泡桐中存在有與能量代謝相關的關鍵蛋白質(zhì)質(zhì)膜ATP酶 (PM-ATPase)，且發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)為植原體在泡桐中存活提供能量。PM-ATPase是氧化磷酸化過程中一種重要的酶，其主要功能是催化ATP水解，并釋放能量將細胞質(zhì)內(nèi)的H+泵出膜外，在植物質(zhì)膜兩側形成跨膜質(zhì)子驅(qū)動力，促進離子及分子的運輸，與植物的生長發(fā)育密切相關[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，毛泡桐被植原體感染后，其PM-ATPase豐度明顯增加，由于PM-ATPase的蛋白質(zhì)的表達量升高，使受感染的泡桐在氧化磷酸化途徑中ATP表現(xiàn)出增加的趨勢，從而滿足植物對能量的需求，這可能是由于植物在受到植原體感染后自身產(chǎn)生的一種適應機制。

光合作用在植物的生長發(fā)育中起著很大的作用，但是研究發(fā)現(xiàn)光合作用可能會受到植原體感染的影響[17-18]。而且許多植物在被植原體感染后，其光合作用和碳水化合物的積累被抑制[19-20]。本研究在以白花泡桐基因組為背景的情況下在毛泡桐發(fā)現(xiàn)了與植物光合作用有關的蛋白質(zhì)景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶 (SBPase) 和PsbR。SBPase是一種影響光合作用的關鍵酶，在碳固定途徑中起著重要作用[21]。Miyagawa等[22]和Tamoi等[23]研究表明將聚球藻和綠藻中的SBPase基因轉入煙草中后發(fā)現(xiàn)轉基因煙草光合固定CO2的效率和光合能力明顯提高。Harrison等[24]發(fā)現(xiàn)抑制該基因的表達會使轉基因植株的光合能力顯著降低，葉面積減小，生長速度明顯降低。本研究從蛋白質(zhì)水平揭示SBPase在泡桐叢枝病患病植株中豐度減少，這可能造成泡桐叢枝病患病植株光合固定CO2的效率和光合能力降低，從而造成光合作用受阻，導致其葉片變黃，這與Miyagawa等[22]和Tamoi等[23]的研究結果一致。PsbR是真核生物光合系統(tǒng)Ⅱ (Photosystem Ⅱ, PS Ⅱ) 的重要組成部分，主要參與氧化反應和PSII的電子傳遞[25-26]。Mou等[20]從轉錄組水平研究發(fā)現(xiàn)泡桐被植原體感染后，PsbP1和PsbR的基因表達下調(diào)，該結果造成了電子傳遞受阻，引起光合作用降低。本研究從蛋白質(zhì)水平揭示PsbR在泡桐叢枝病患病植株中表達明顯下調(diào)，并且引起了PsbP和PsbQ表達降低，造成了電子傳遞受阻，該結果說明植原體的感染影響了泡桐的光合作用。

通過對上述能量產(chǎn)生途徑的差異蛋白質(zhì)功能的分析比較，表明植原體感染可能導致泡桐光合作用下降，從而影響泡桐的生長發(fā)育，這些研究將有助于對植原體與泡桐相互作用的分子機制的了解，為泡桐新品種育種和抗性育種奠定了基礎，也為其他植物植原體病害的研究提供了借鑒。