陳海濤 邵亞林 趙展平,2 趙 平,2 劉小燭 丁 勇

(1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

肌動(dòng)蛋白普遍存在于真核細(xì)胞骨架中，并構(gòu)成微絲的主要組分，具有高度保守性，參與細(xì)胞分裂、內(nèi)吞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞活動(dòng)[1-3]。肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白 (ARPs) 與Actin在進(jìn)化上屬于同一個(gè)保守的actin蛋白質(zhì)家族，兩者均含有一個(gè)與ATP或ADP相結(jié)合的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)[4]，在核苷酸序列上ARPs與Actin具有不同程度的一致性[5-6]。根據(jù)與Actin不同的相似度，目前ARPs被劃分為ARP～ARP11等11個(gè)亞家族，其中大多數(shù)成員已經(jīng)在真核生物中被發(fā)現(xiàn)[7-8]。相同的ARPs亞家族成員在不同的物種中均具有很高的同源性。真核生物中的ARPs又可以分為2類，一類是與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和微管蛋白相關(guān)的ARPs (ARP1、ARP2、ARP3、ARP10和ARP11)，另一類是定位于細(xì)胞核的ARPs (ARP4～9)，可以與肌動(dòng)蛋白和其他核蛋白組成多種多蛋白復(fù)合體來(lái)參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[9]。其中ARP7則是較為特殊的一種蛋白，研究表明在細(xì)胞分裂間期ARP7定位于細(xì)胞核中，然后在缺乏核膜的有絲分裂細(xì)胞中，ARP7則分散在細(xì)胞質(zhì)中，具有一定的細(xì)胞周期依賴性[10-11]；ARP7還可與ARP9結(jié)合形成ARP7/9二聚體發(fā)揮重要功能[12]。因此，關(guān)于ARP7的研究備受關(guān)注。

樟葉越桔 (Vacciniumdunalianum) 為杜鵑花科 (Ericaceae) 越桔屬 (Vaccinium) 常綠灌木，具有多方面生理活性[13]，因其野生植株富含天然美白活性劑熊果苷和6′-O-咖啡酰熊果苷 (CA)，近年來(lái)被作為特殊民族資源植物得到重視和研究[14-18]。目前ARP7基因已經(jīng)在大豆 (Glycinemax) (XM_003546842.3)、蘋(píng)果 (Malusdomestica) (XM_00834

4381.2)、梅花 (Prunusmume) (XM_008233032.1)、核桃 (Juglansregia) (XM_018961324.1)、川桑 (Morusnotabilis) (XM_010092522.2)、葡萄 (Vitisvinifera) (XM_002278219.3)、甜橙 (Citrussinensis) (XM_006482803.2) 和擬南芥 (Arabidopsisthaliana) (NM_115947.3) 等多個(gè)物種中得以克隆，而有關(guān)樟葉越桔ARP7基因的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究在前期獲得樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) (NCBI登錄號(hào)PRJNA285946)[19]的基礎(chǔ)上，篩選獲得ARP7基因cDNA片段，采用RACE-PCR技術(shù)克隆了樟葉越桔VdARP7基因cDNA序列，并應(yīng)用半定量PCR技術(shù)分析了VdARP7基因在樟葉越桔不同組織中的表達(dá)特征，為后期深入研究樟葉越桔ARP7生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

2017年4月8日，采取云南省楚雄州武定縣獅山鎮(zhèn)滑坡村野生樟葉越桔葉芽、嫩葉、老葉、花芽和花等組織，立即置于液氮速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit (With gDNase) 和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根公司，PCR Mix試劑、pMD19-T載體、感受態(tài)細(xì)胞JM109、DL2000 DNA Marker、RNaseH、dATP、末端轉(zhuǎn)移酶TdT購(gòu)自TAKARA公司，其他相關(guān)試劑購(gòu)于昆明滇工科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得VdARP7基因675 bp的cDNA片段 (Unigene25940_2A, 圖1)，利用primer 5.0設(shè)計(jì)3′RACE-PCR引物，包括反轉(zhuǎn)錄引物Adaptor-Oligo (dT)17：5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T17)-3′，接頭引物AP：5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′，特異性引物3′GSP-1：5′-TGTTGGCGAGGCTCTATTCC-3′和3′GSP-2：5′-GGCACTGCTTCTATGACTGG-3′。根據(jù)3′cDNA序列設(shè)計(jì)5′RACE-PCR引物，包括反轉(zhuǎn)錄引物5′GSP-1：5′-GGTTCTCAGGCATGTACTCTGGAGG-3′，特異性引物5′GSP-2：5′-GTGGCTTCTTTCTGGAACCTAT-3′和5′GSP-3：5′-GAATAGAGCCTCGCCAACAG-3′。基因半定量PCR引物ACT-S：5′-TGTTGGCGAGGCTCTATT-3′和ACT-A：5′-AAGGGTGGCTTCTTTCTG-3′。

1.3 RNA提取和第一鏈cDNA合成

按照OMEGA公司RNA提取試劑盒操作說(shuō)明，提取樟葉越桔不同組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，使用Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定OD (A260/A280) 值。取葉芽總RNA為模板，分別以Adaptor-Oligo (dT)17和5′ GSP-1為引物反轉(zhuǎn)錄合成3′-RACE和5′-RACE的第1鏈cDNA，取等量的葉芽、嫩葉、老葉、花芽和花總RNA為模板，以O(shè)ligo (dT)17為引物分別反轉(zhuǎn)錄合成半定量PCR的第1鏈cDNA。按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明操作。

1.4 樟葉越桔VdARP7基因cDNA克隆與測(cè)序

取3′ RACE第1鏈cDNA模板2 μL，3′ GSP-1和AP引物各1 μL，2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立25 μL第1輪PCR反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取上述第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL為模板，3′ GSP-2和AP為引物，建立同第1輪PCR反應(yīng)的體系和擴(kuò)增程序。

圖1 樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的VdARP7基因cDNA序列Fig.1 The cDNA sequence of VdARP7 gene was isolated by transcriptome sequencing method from leaf bud of V.dunalianum

用RNase H消化合成的5′ RACE第1鏈cDNA，去除mRNA：cDNA雜合鏈中的mRNA，用TdT酶促反應(yīng)獲得3′ 末端加上polyA的5′ RACE第1鏈cDNA。取上述cDNA 2 μL，10 × PCR Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，10 μmol/L Adaptor-Oligo (dT)171 μL，25 mmol/L MgCl21.6 μL，500 UTaqDNA Polymerase 0.2 μL，建立20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火2 min，72 ℃延伸10 min，5個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min。合成5′RACE-PCR的第2鏈cDNA。取上述雙鏈cDNA產(chǎn)物2 μL為模板，5′ GSP-2和AP為引物建立第1輪5′ RACE-PCR反應(yīng)；取5′ RACE第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μL為模板，5′ GSP-3和AP為引物建立第2輪5′ RACE-PCR反應(yīng)。5′ RACE-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同3′ RACE。

3′ RACE和5′ RACE的第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的cDNA片段經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化EscherichiacoliJM109，在AMP抗性的LB平板上挑取重組質(zhì)粒，利用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送至深圳華大基因公司測(cè)序。

1.5 樟葉越桔VdARP7基因序列分析

使用NCBI中Blastx工具比對(duì)相似性，ORF finder工具預(yù)測(cè)基因開(kāi)放閱讀框，Conserved Domain Search (CD-Search) 服務(wù)器 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析蛋白功能域；用DNAMAN分析基因密碼子和氨基酸序列并比對(duì)序列同源性。

1.6 樟葉越桔VdARP7基因半定量PCR分析

分別取樟葉越桔不同組織第1鏈cDNA 2 μL，ACT-S和ACT-A引物各1 μL，2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立25 μL半定量PCR反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，用Quantity One軟件分析樟葉越桔VdARP7基因在樟葉越桔葉芽、嫩葉、老葉、花芽和花等不同組織中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟葉越桔不同組織總RNA提取

總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖 (圖2) 顯示，從樟葉越桔葉芽、嫩葉、老葉、花芽和花中提取總RNA的28S和18S rRNA條帶均清晰、無(wú)拖尾，且前者亮度約為后者亮度的2倍；紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同組織總RNA的OD (A260/A280)值均在1.8～2.0之間。表明本實(shí)驗(yàn)提取的樟葉越桔不同組織總RNA的完整性較好、純度較高，可滿足后續(xù)基因克隆和半定量表達(dá)分析所需的高質(zhì)量總RNA要求。

1. 葉芽；2. 嫩葉；3. 老葉；4. 花芽；5. 花

2.2 樟葉越桔VdARP7基因cDNA克隆

3′ RACE和5′ RACE第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均未顯示有效特異性條帶，實(shí)驗(yàn)在3′ RACE和5′ RACE第1輪PCR引物內(nèi)側(cè)分別設(shè)計(jì)第2條特異性引物，進(jìn)行半巢式PCR，增加了RACE-PCR擴(kuò)增特異性。3′ RACE第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示為500～750 bp之間的單一條帶 (圖3中A)，經(jīng)回收、克隆、測(cè)序，為包括上下游引物的548 bp序列，除去接頭引物獲得樟葉越桔VdARP7基因cDNA 3′ 末端長(zhǎng)526 bp序列，其5′ 末端與VdARP7基因已知cDNA序列 (圖1) 3′ 末端有237 bp的重疊序列，具有真核生物mRNA的3′ 末端PolyA尾巴結(jié)構(gòu)，表明本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3′ RACE技術(shù)成功克隆了樟葉越桔VdARP7基因cDNA 3′末端完整序列。5′RACE第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳圖中顯示為250 bp左右的單一條帶 (圖3中B)，經(jīng)回收、克隆、測(cè)序，為包括上下游引物的277 bp序列，除去接頭引物獲得樟葉越桔VdARP7基因cDNA長(zhǎng)222 bp序列，該序列與已知675 bp的cDNA序列的100～321位核苷酸序列完全重疊，表明本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用5′ RACE技術(shù)克隆的cDNA序列未能包含樟葉越桔VdARP7基因cDNA 5′末端完整序列。因此，本實(shí)驗(yàn)將已知cDNA序列和3′ 末端完整序列拼接獲得長(zhǎng)964 bp的樟葉越桔VdARP7基因cDNA序列。

A. 3′ RACE；B. 5′ RACE；M. DL2000 DNA Marker

2.3 樟葉越桔VdARP7基因序列分析

序列相似性Blastx比對(duì)結(jié)果顯示，樟葉越桔VdARP7基因cDNA序列與大豆、葡萄、蘋(píng)果和梨等11種高等植物ARP7基因具有較高的同源性，序列相似性高達(dá)80%以上 (表1)。表明本實(shí)驗(yàn)克隆獲得的cDNA序列為樟葉越桔ARP7基因序列，命名為VdARP7，該基因?qū)儆诩?dòng)蛋白相關(guān)蛋白ARPs家族基因中的一員。

表1 樟葉越桔VdARP7基因與其他物種ARP7基因相似性比較結(jié)果Table 1 Similarity comparison between VdARP7 of V.dunalianum and ARP7 from other plants

ORF finder分析結(jié)果表明VdARP7基因964 bp的cDNA序列從第1～675位核苷酸可連續(xù)編碼225個(gè)氨基酸，676～678位核苷酸TAG構(gòu)成終止密碼子，3′ 末端286 bp序列為完整的3′ UTR區(qū)，包含真核生物mRNA 3′ 末端典型特征結(jié)構(gòu)PolyA尾巴 (圖4)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果 (圖5) 顯示實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)的225個(gè)氨基酸殘基序列包含1個(gè)NBD_sugar-kinase_HSP70_actin保守結(jié)構(gòu)域，表明樟葉越桔VdARP7基因編碼的VdARP7蛋白屬于ARPs亞家族成員，在進(jìn)化上類似于Actin蛋白同屬于一個(gè)保守的actin蛋白質(zhì)家族。

將VdARP7氨基酸序列與表1中已知物種的ARP7蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果 (圖6) 表明：本實(shí)驗(yàn)克隆的VdARP7基因的964 bp cDNA片段推導(dǎo)的VdARP7蛋白225個(gè)氨基酸序列與桃、川桑和蘋(píng)果等12個(gè)已知物種ARP7蛋白序列在羧基C-末端具有較高的相似性。相比所分析的其他12個(gè)物種ARP7蛋白序列 (361～362 aa)，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)獲得的VdARP7蛋白氨基酸序列在氨基N-末端少了136～137 aa，原因是實(shí)驗(yàn)應(yīng)用5′ RACE技術(shù)未成功克隆到樟葉越桔VdARP7基因cDNA 5′ 末端完整序列。

圖4 樟葉越桔VdARP7基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4 The nucleotide sequences of VdARP7 gene and its deduced amino acid sequences

圖5 樟葉越桔VdARP7氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Conserved domain of VdARP7 protein from V.dunalianum

圖6 樟葉越桔VdARP7和其他植物ARP7的氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Comparison of the amino acid sequences between VdARP7 of V.dunalianum and ARP7 from other plants

2.4 樟葉越桔VdARP7基因半定量PCR分析

根據(jù)樟葉越桔不同組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)濃度值，取等量的葉芽、嫩葉、老葉、花芽和花總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，再取等量的第1鏈cDNA進(jìn)行VdARP7基因半定量PCR擴(kuò)增，其他條件一致。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 (圖7) 顯示VdARP7基因在樟葉越桔葉芽、嫩葉、老葉、花芽、花等組織中均有明顯的表達(dá)，且VdARP7基因在實(shí)驗(yàn)的樟葉越桔5種組織中的表達(dá)量無(wú)明顯差異，推測(cè)VdARP7基因是組成型表達(dá)基因，能在樟葉越桔不同組織中穩(wěn)定表達(dá)。

(M為DL2000 DNA Marker；1～5依次為葉芽、嫩葉、老葉、花芽、花)

3 結(jié)論與討論

肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白ARPs與肌動(dòng)蛋白Actin共同組成了actin超家族蛋白，并在生物細(xì)胞中發(fā)揮著重要功能[7-8]，ARP7作為actin亞家族蛋白ARPs的一員，其基因及其功能已經(jīng)在擬南芥和酵母等真核生物中得到研究[20-21]。本實(shí)驗(yàn)在樟葉越桔中分離克隆到ARP7基因964 bp的cDNA序列，該基因被命名為VdARP7?？寺〉腣dARP7基因序列包括完整的3′ UTR區(qū)域和真核生物mRNA 3′ 末端PolyA尾巴特征結(jié)構(gòu)，第1～675位核苷酸屬于開(kāi)放閱讀框部分區(qū)域，推測(cè)連續(xù)編碼的225個(gè)氨基酸與蘋(píng)果和葡萄等已知植物的ARP7蛋白C-末端序列具有較高的相似性，且包含actin蛋白家族NBD_sugar-kinase_HSP70_actin保守結(jié)構(gòu)域。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用5′ RACE技術(shù)未成功克隆到推測(cè)編碼VdARP7蛋白N-末端氨基酸殘基的VdARP7基因cDNA 5′ 末端完整序列。分析原因可能有兩點(diǎn)：一是目的基因模板中存在特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)，5′ RACE實(shí)驗(yàn)中模板鏈反轉(zhuǎn)錄合成時(shí)提前終止；二是5′ RACE-PCR引物與目的基因序列中間部位存在非特異性結(jié)合點(diǎn)，導(dǎo)致了錯(cuò)配。因此，對(duì)于VdARP7基因cDNA全長(zhǎng)序列克隆，仍需通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和反轉(zhuǎn)錄程序等方法進(jìn)一步研究。

研究表明ARP7主要定位于細(xì)胞核中，推測(cè)包含ARP7在內(nèi)的核ARPs可以與actin等蛋白質(zhì)組成多蛋白復(fù)合物參與染色質(zhì)重塑、DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程[22-25]。Kandasamy等研究表明ARP7在擬南芥中為組成型表達(dá)的核蛋白，是擬南芥正常胚胎發(fā)生和花器官脫落所必需的ARPs，ARP7基因敲除則影響植株多個(gè)發(fā)育途徑，如根部生長(zhǎng)緩慢、花的脫落時(shí)間滯后、植株生育力減低等[21]。本研究克隆的VdARP7基因在樟葉越桔葉芽、嫩葉、老葉、花芽、花等不同組織中能穩(wěn)定表達(dá)，表明ARP7基因在樟葉越桔中是組成型表達(dá)基因；蛋白氨基酸序列對(duì)比分析結(jié)果表明來(lái)自不同植物的ARP7具有高度保守性。推測(cè)ARP7在植物細(xì)胞中與傳統(tǒng)肌動(dòng)蛋白actin一樣是組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)，并在植物生長(zhǎng)和發(fā)育等生理方面發(fā)揮著重要作用。在植物中已深入研究的Actin基因[26-33]，因其表達(dá)穩(wěn)定，常被作為內(nèi)參基因使用[34-36]。暗示同樣具有組織穩(wěn)定性表達(dá)特征的ARP7基因有可能為植物其他功能基因表達(dá)研究提供了一個(gè)內(nèi)參基因新選擇。

本研究在前期樟葉越桔葉芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上，篩選獲得VdARP7基因675 bp cDNA片段，應(yīng)用RACE技術(shù)克隆了VdARP7基因包括PolyA尾巴和3′ UTR完整區(qū)域的964 bp cDNA片段，推導(dǎo)編碼VdARP7蛋白C-末端225個(gè)氨基酸殘基序列。VdARP7屬于ARPs亞家族基因新成員，與多種高等植物已知ARP7基因具有較高的同源性，包含1個(gè)Actin蛋白超家族NBD_sugar-kinase_HSP70_actin保守結(jié)構(gòu)域。半定量PCR實(shí)驗(yàn)表明VdARP7基因能在樟葉越桔葉芽、嫩葉、老葉、花芽和花等不同組織中穩(wěn)定表達(dá)。