董麗丹， 魏長平， 李中田， 汪鳳明

(1. 長春理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 吉林 長春 130022;2. 長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校, 吉林 長春 130031; 3. 中水東北勘測設(shè)計(jì)研究有限責(zé)任公司, 吉林 長春 130061)

1 引 言

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用醫(yī)用可吸收止血材料處理傷口受到科研人員和醫(yī)務(wù)工作者的廣泛關(guān)注，世界范圍內(nèi)，可吸收止血材料逐漸成為醫(yī)療和制藥行業(yè)發(fā)展的熱門方向[1-4]。殼聚糖因具有抗菌、止血和良好的組織相容性，且其凝血過程不依賴凝血系統(tǒng)等性能而被廣泛作為止血材料[5-8]。

近年來通過復(fù)合一些具有止血、消炎、抗菌效果的藥物或離子來提高殼聚糖及其衍生物類止血材料的止血效果研究見諸文獻(xiàn)。尹剛等[9]通過劑型改造和結(jié)構(gòu)改變向殼聚糖中加入Ca2+及Zn2+，研制出一種新型殼聚糖止血粉，通過凝血、止血實(shí)驗(yàn)，證明了這種新型止血粉劑是一種有效、安全、可降解的生物止血材料。羧甲基化的殼聚糖較單純的殼聚糖具有更好的水溶性、生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)，且無細(xì)胞毒性作用，可促進(jìn)細(xì)胞生長，其止血作用比之殼聚糖更加優(yōu)秀[10-13]。Ag+能通過緩釋技術(shù)使微生物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成微生物死亡或使其產(chǎn)生功能性障礙，從而達(dá)到抗菌效果[14]。TiO2具有廣譜長效抗菌、屏蔽紫外線等優(yōu)點(diǎn)，目前已被國家批準(zhǔn)為食品添加劑[15]。

本文首先在殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中引入羧甲基，得到的羧甲基殼聚糖再與硝酸銀和納米二氧化鈦溶液充分反應(yīng)，得到羧甲基殼聚糖復(fù)合止血材料。采用 FTIR、XRD、SEM等手段對復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征并考察了其凝血、止血性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羧甲基殼聚糖絡(luò)合了Ag+和納米TiO2生成了新的復(fù)合物，且較羧甲基殼聚糖具有更好的止血性能。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 樣品制備

羧甲基殼聚糖：向三口燒瓶中加入一定量的脫乙酰度為80.0～95.0殼聚糖和分析純的異丙醇，攪拌。加入30%NaOH溶液，將6 g分析純氯乙酸分4次加入溶液中，加熱反應(yīng)3 h，加入蒸餾水，調(diào)pH為7.0。抽濾，用70%甲醇、95%乙醇、無水乙醇洗滌。所得產(chǎn)品放入烘箱烘干，即得羧甲基殼聚糖。

羧甲基殼聚糖銀：稱取一定量羧甲基殼聚糖溶入蒸餾水中，再加入0.10 mol/L 的AgNO3溶液，加熱攪拌2 h。所得產(chǎn)品放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥，研磨成粉。

羧甲基殼聚糖吸附納米TiO2：首先進(jìn)行納米TiO2粉體改性。稱取一定量分析純納米TiO2加入到70 mL水中，調(diào)pH為5.0，加入月桂酸鈉，反應(yīng)30 min，干燥，得白色納米TiO2粉體，研磨成粉，備用。稱取微量改性納米TiO2溶于蒸餾水中，攪拌，再加入一定量羧甲基殼聚糖，攪拌3 h，烘干，研磨成粉。

羧甲基殼聚糖銀吸附納米TiO2復(fù)合材料：稱取少量改性納米TiO2溶于蒸餾水中，攪拌，分別加入一定量羧甲基殼聚糖和0.10 mol/L的AgNO3溶液，攪拌，制得Ag+-TiO2-CMCS混合液，洗滌后，干燥10 h，得到成品。

2.2 樣品分析與性能測試

羧甲基殼聚糖取代度的測定：測定羧甲基殼聚糖的取代度，采用的方法是電位滴定法。具體步驟：將0.2 g羧甲基殼聚糖樣品溶于20 mL濃度為0.1 mol/L的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液中，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行緩慢滴定，用pH計(jì)觀察pH值的變化情況，分別記下pH值是2.1和4.3時所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V1和V2,通過公式(1)、(2)計(jì)算羧甲基殼聚糖取代度(KDS)：

KDS=0.161A/(1-0.058A) ，

(1)

A=(V1-V2)M，

(2)

式中：A代表每克樣品中羧甲基的物質(zhì)的量，mmol；0.161是每個乙酸氨基葡萄糖殘基的物質(zhì)的量，mmol；0.058是每毫克當(dāng)量的羧甲基質(zhì)量；M代表NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；W代表樣品的凈重。

紅外光譜(FT-IR)：在傅里葉變換紅外光譜儀上，使用KRS-5型ATR探頭，用反射法在500～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，并記錄各樣品的紅外光譜。

射線衍射光譜(XRD)：室溫下使用Rigaku D/MAX-RB型X射線衍射儀記錄樣品的X射線衍射圖譜。X射線源為Cu-Kα線，電壓為40 kV，電流為50 mA，掃描范圍為10°～80°，掃描速度為10(°)/min。

掃描電鏡(SEM)：為了更明顯地看見混合了金屬離子，所以將其鋪成膜。用Quanta-200掃描電鏡觀察膜表面。

樣品的凝血、止血性能測試：為了測試實(shí)驗(yàn)樣品的凝血和止血性能，本文建立了動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選用體重在18～26 g之間的成年雄性昆明鼠，進(jìn)行樣品的體外凝血和止血實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 樣品結(jié)構(gòu)測試分析

3.1.1 羧甲基殼聚糖取代度的測定

根據(jù)取代度的測定方法，在本文實(shí)驗(yàn)條件下，制得的羧甲基殼聚糖的取代度為1.43。

3.1.2 樣品的紅外光譜分析

殼聚糖和羧甲基殼聚糖的紅外光譜如圖1所示。由圖像分析可知，CS：波數(shù)3 423 cm-1處屬于N—H鍵伸縮振動吸收峰，2 876 cm-1是—CH—鍵對稱伸縮振動吸收峰，1 596 cm-1處是—COO鍵不對稱伸縮振動吸收帶，1 380 cm-1處是C—H鍵對稱變形振動和彎曲振動吸收帶，1 080 cm-1處吸收峰很寬，是C—O鍵吸收帶。CMCS：波數(shù)3 386 cm-1處是N—H鍵伸縮振動吸收峰，2 918 cm-1處是—CH—鍵不對稱伸縮振動吸收峰，1 593 cm-1處是酰胺Ⅱ吸收峰，1 413 cm-1處有兩個吸收峰，故判斷為羰基對稱伸縮振動吸收峰，1 072 cm-1處為醚鍵C—O—C吸收峰。由于圖像在3 423 cm-1和1 380 cm-1處吸收峰發(fā)生了明顯的偏移,說明取代反應(yīng)分別發(fā)生在N位、O位上，所得產(chǎn)物為N，O-羧甲基殼聚糖。

CMCS復(fù)合Ag+、納米TiO2紅外光譜如圖2所示。從圖中可看出，隨著Ag+和TiO2的加入，CMCS于3 386 cm-1處羥基和胺基的伸縮振動吸收寬峰發(fā)生了波數(shù)移動，這表明Ag+、TiO2和CMCS間有較強(qiáng)的氫鍵相互作用；此外，CMCS復(fù)合物在1 072 cm-1處羥基伸縮振動吸收峰移至低波數(shù)1 062 cm-1，這進(jìn)一步證明了Ag+、TiO2和CMCS間存在較強(qiáng)的氫鍵相互作用。

圖1 CS和CMCS的紅外光譜圖

Fig.1 FT-IR spectra of chitosan and carboxymethyl chitosan

圖2 CMCS復(fù)合Ag+、TiO2的紅外光譜圖。

Fig.2 FT-IR spectra of carboxymethyl chitosan composite Ag+， TiO2.

3.1.3 樣品的射線衍射分析

CS和CMCS的XRD如圖3所示。研究表明，殼聚糖X射線衍射圖譜峰的強(qiáng)度與其結(jié)晶性有關(guān)，結(jié)晶性越強(qiáng)則峰的強(qiáng)度也越強(qiáng)；反之，峰的強(qiáng)度則減弱。殼聚糖結(jié)構(gòu)單元引入羧甲基后削弱了2、6位羥基與3位羥基的氫鍵作用，使殼聚糖的結(jié)晶性減弱，因而峰的強(qiáng)度減小。

CMCS復(fù)合Ag+、納米TiO2的XRD如圖4所示。羧甲基殼聚糖在2θ=19.56°處出現(xiàn)衍射吸收峰，可以看出CMCS是非晶態(tài)的。當(dāng)CMCS復(fù)合Ag+時,其2θ=27.42°，36.11°，54.22°，67°處出現(xiàn)衍射峰，這些衍射峰與 JCDPS卡片上立方晶系銀的衍射峰基本一致，分別對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)晶態(tài)銀卡片上的(111)、(200)、(220)、(311)晶面，說明成功復(fù)合了銀離子。當(dāng)CMCS復(fù)合納米TiO2時，在44.34°處出現(xiàn)特征衍射峰，表明CMCS復(fù)合了納米TiO2。

圖3 CS和CMCS的XRD圖

圖4 CMCS復(fù)合Ag+、TiO2的XRD圖。

Fig.4 XRD patterns of carboxymethyl chitosan composite Ag+, TiO2.

3.1.4 樣品的掃描電鏡分析

羧甲基殼聚糖復(fù)合Ag+、TiO2的掃描電鏡圖如圖5所示，(a)、(b)、(c)分別為Ag+-CMCS、TiO2-CMCS、Ag+-TiO2-CMCS的SEM圖片。

通過圖片可以看出CMCS的粒徑為14.8 nm左右，Ag+粒徑為143.5 nm左右，納米TiO2的粒徑為267.2 nm左右。Ag+和納米TiO2負(fù)載在CMCS的表面和內(nèi)部，3種物質(zhì)分布均勻。

圖5 Ag+-CMCS(a)、TiO2-CMCS(b)和Ag+-TiO2-CMCS(c)的掃描電鏡圖。

Fig.5 SEM micrographs of Ag+-CMCS(a)， TiO2-CMCS(b) and Ag+-TiO2-CMCS(c), respectively.

3.2 樣品性能測試分析

3.2.1 凝血測試分析

樣品的凝血性能測試方法：向每個試管中加入1 mL濃度為 0.10 mol/L草酸鉀溶液作為抗凝劑備用。取全血5 mL分別放入5個試管中，按每毫升血液加入0.2 g樣品粉末，每隔數(shù)秒傾斜試管，發(fā)現(xiàn)血液凝集立即記錄時間，每個樣品測試3組平行數(shù)據(jù)，取平均值，結(jié)果見表1。

由凝血測試時間可知，CMCS 的凝血時間要好于CS，這是由于CMCS的氨基具有活性，發(fā)生質(zhì)子化生成陽離子，進(jìn)而吸引帶有負(fù)電荷的血小板和紅細(xì)胞，另外，氨基的親水性能會增加血纖蛋白原吸附的數(shù)量，加速凝血過程從而縮短了凝血時間。Ag+-TiO2-CMCS的凝血效果要優(yōu)于Ag+-CMCS和TiO2-CMCS的凝血效果，同時Ag+-CMCS和TiO2-CMCS的凝血效果要好于CS和CMCS的凝血效果。

表1 樣品的凝血時間測試

3.2.2 止血測試分析

樣品的止血性能測試方法：將小鼠放進(jìn)離心管中使其頭部固定，于尾尖3 cm處切斷，制造出血創(chuàng)面?？瞻讓φ諏?shí)驗(yàn)使尾尖在自然狀態(tài)下止血，從切斷尾尖開始，到不再有血滴滲出，記錄止血時間，分別測試3組平行數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值；另外5組樣品，在切斷小鼠尾尖后，取0.2 g樣品均勻涂抹于傷口，使尾部保持自然狀態(tài)不動，使傷口與樣品始終接觸，從切斷尾尖開始，直到不再出血為止，記錄止血時間，5個樣品分別測試3組平行數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值，結(jié)果見表2。

表2 樣品的止血時間測試

從平均止血時間來看，Ag+-TiO2-CMCS的止血效果要優(yōu)于Ag+-CMCS和TiO2-CMCS的止血效果，同時Ag+-CMCS和TiO2-CMCS的止血效果要好于CS和CMCS的止血效果。

4 結(jié) 論

殼聚糖經(jīng)羧甲基化制得羧甲基殼聚糖，向其中加入Ag+和納米TiO2制得羧甲基殼聚糖復(fù)合止血材料。

羧甲基殼聚糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)表明：添加了Ag+和納米TiO2的羧甲基殼聚糖其IR圖譜顯示，在3 386 cm-1和1 062 cm-1處吸收峰發(fā)生了位移，XRD圖譜表現(xiàn)出相應(yīng)的晶行行態(tài)，以上說明Ag+和納米TiO2與羧甲基殼聚糖進(jìn)行了復(fù)合。SEM圖像可以更直觀地看出：CMCS的粒徑為14.8 nm左右，Ag+粒徑為143.5 nm左右，TiO2的粒徑為267.2 nm左右，Ag+和納米TiO2負(fù)載在CMCS的表面和內(nèi)部，3種物質(zhì)分布均勻。

復(fù)合物的凝止血測試數(shù)據(jù)表明：添加了Ag+和納米TiO2的羧甲基殼聚糖可以有效地縮短凝血和止血時間。其中單獨(dú)添加Ag+和納米TiO2制備的止血粉相比，添加納米TiO2止血粉其止血效果要稍好于添加Ag+止血粉。同時添加Ag+和納米TiO2止血粉，在復(fù)合效應(yīng)作用下獲得了更優(yōu)的凝血和止血性能。