王琴飛，吳秋妃，徐 緩，林立銘，張振文

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

木薯亦稱(chēng)樹(shù)薯(ManihotesculentaCrantz)，與馬鈴薯、甘薯并列為世界三大薯類(lèi)作物。我國(guó)木薯種植主要集中在廣西、廣東、云南和海南等省區(qū)。木薯塊根是生物能源和淀粉加工的重要原料，而莖稈、葉片是其主要的副產(chǎn)物[1]。雖然木薯葉片飼料化利用是重要的途徑之一，但由于其含有大量的氰化物、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，制約了木薯葉的推廣利用[2]。因此，研究者指出，通過(guò)提取分離木薯葉活性物質(zhì)的藥用價(jià)值，是開(kāi)發(fā)木薯葉藥用價(jià)值的又一途徑[1, 3-4]。

研究表明，木薯葉中不僅含有豐富的類(lèi)胡蘿卜素，黃酮類(lèi)物質(zhì)含量也很高[3, 5]。黃酮類(lèi)化合物具有消除氧自由基、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒等生理活性[6]。研究人員發(fā)現(xiàn)木薯葉經(jīng)搗爛、煮熟后食用，不僅可以作為蔬菜食用，可以治療膀胱炎，并且孕婦和哺乳期的婦女都可以食用，因此推測(cè)木薯葉的藥效與其活性物質(zhì)有關(guān)[3, 7]。目前為止，在木薯葉中發(fā)現(xiàn)了8種黃酮類(lèi)化合物，分別是蘆丁、煙花甙、槲皮素、山奈酚、三羥基黃酮醇、金絲桃苷、剌槐甙、水仙甙。其中蘆丁和煙花甙是木薯葉中的主要活性物質(zhì)[8]。Isao Kubo等[8]發(fā)現(xiàn)，巴西木薯葉片黃酮類(lèi)化合物槲皮素、山奈酚、蘆丁含量分別達(dá)到了840、840、4620 mg/kg， 并且這3種化合物的抗氧化性效果顯著。我國(guó)研究者也對(duì)木薯葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取分離、生物活性鑒定等進(jìn)行了探索研究[4, 9-11]，而在黃酮類(lèi)物質(zhì)的定性定量分析方面研究較少，何翠薇等[12]對(duì)木薯葉中蘆丁的提取方法和HPLC檢測(cè)方法進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)不同采收期木薯葉片中蘆丁含量存在較大差異，但木薯葉中多個(gè)黃酮類(lèi)物質(zhì)的定性定量分析還未有詳細(xì)的研究報(bào)道。因此，本研究以木薯葉片為材料，期望通過(guò)提取方法和色譜條件的優(yōu)化， 建立一個(gè)快速提取木薯葉黃酮醇類(lèi)物質(zhì)和同時(shí)分析多個(gè)黃酮類(lèi)物質(zhì)的HPLC方法，為木薯葉的資源化利用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器設(shè)備

木薯葉片于海南儋州國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃采收，采集后迅速在60 ℃水浴鍋中脫氰處理10 min，瀝干水分，在60 ℃的烘箱內(nèi)烘干8 h，最后用植物粉碎機(jī)粉碎后過(guò)100目篩，樣品粉末保存于-8 ℃冰箱待用。根據(jù)文獻(xiàn)采集不同品種的幼葉、嫩葉和成熟葉，幼葉為頂部向下1～4片葉，嫩葉為頂部向下4～8片葉，成熟葉為頂部向下8～12片葉。

標(biāo)準(zhǔn)樣品蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚(純度≥98.0 %)購(gòu)買(mǎi)于上海融合醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。甲醇為色譜純，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma公司。無(wú)水乙醇、磷酸等為分析純。

采用Agilent1260型液相色譜系統(tǒng)分析黃酮類(lèi)物質(zhì)，配備自動(dòng)進(jìn)樣器(型號(hào):G1329B)、二極管陣列列檢測(cè)器(型號(hào):G1315D)和柱溫箱(型號(hào)：G1316A)。色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)(美國(guó)Agilent1260公司)；超純水由Elix3+Synergy超純水系統(tǒng)制備，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Millipore公司；烘箱(型號(hào)FD115)購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)BINDER公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木薯葉黃酮醇的提取 取木薯葉粉末的0.2000 g于三角瓶中，加入40 %的乙醇15.0 mL，旋渦振蕩混勻，超聲提取30 min(70 ℃，4 kHz)，待樣品冷卻后，用40 %的乙醇補(bǔ)重，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，離心10 min(10 000 r/min，25 ℃)；上清液即為待測(cè)液，放置于4～8 ℃冰箱待測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 色譜條件 利用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇(A)和0.2 %磷酸水(B)溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋浩鹗紴?0 % A， 60 % B；到15 min時(shí)A為58 %， B為42 %； 20 min時(shí)A為80 % ，B為20 % ，到22 min時(shí)A為40 % ，B為60 %，平衡柱子5 min，進(jìn)下一個(gè)樣；流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；進(jìn)樣量10 μl；柱溫40 ℃。所有樣品進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。采用外標(biāo)法定量。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 分別稱(chēng)取適量的蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)樣品，用色譜甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.1、3.0、4.0 mg/mL單標(biāo)母液保存于-20 ℃，再用色譜甲醇稀釋依次稀釋配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后使用。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以峰面積(mV)為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

1.2.4 儀器精密度試驗(yàn) 任意選取一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，進(jìn)樣10 μl，按1.2.2的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定蘆丁的峰面積，考察儀器的精密度。

1.2.5 方法重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)選擇一個(gè)樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算樣品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚峰面積變化的RSD值，考察檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.2.6 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn) 任意選擇一個(gè)加標(biāo)樣品，在室溫下放置，每隔4 h測(cè)定其響應(yīng)值，計(jì)算木薯葉片樣品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚濃度變化的RSD值，考察樣品在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.7 樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取木薯葉片粉末0.2 g左右，按高、中、低3個(gè)濃度水平加標(biāo)，每個(gè)水平重復(fù)3次，按1.2.1提取方法，利用40 %的乙醇溶液提取蘆丁和煙花苷，80 %的乙醇溶液提取槲皮素和山奈酚，進(jìn)行回收率和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，由回歸方程計(jì)算樣品濃度，并計(jì)算樣品平均回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

據(jù)報(bào)道，木薯中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取效果受提取溶劑的比例，料液比影響較大，超聲時(shí)間和提取溫度影響較小[11]。因此，在本實(shí)驗(yàn)中僅考察了乙醇比例和料液比對(duì)木薯葉黃酮醇物質(zhì)的影響，以此確定最佳的提取條件。

2.1.1 乙醇比例的影響 在0.2 g木薯粉末中，加入10 mL 比例分別為10 %～100 %的乙醇溶液。在70 ℃條件下超聲提取30 min，考察乙醇比例對(duì)4種黃酮醇物質(zhì)提取效果的影響。如圖1所示，在木薯葉片中檢測(cè)到蘆丁，煙花苷和槲皮素3種黃酮醇類(lèi)物質(zhì)，不同的乙醇濃度，3種黃酮醇物質(zhì)的的提取效率不同，其中，40 %～50 %的乙醇濃度有利于蘆丁和煙花苷的提取，2種物質(zhì)都在乙醇比例為40 %時(shí)提取量達(dá)到最高，含量分別達(dá)到5222.3、1036.2 μg/g；而70 %～80 %比例的乙醇有利于槲皮素的提取，最高提取量達(dá)到11.4 μg/g。在所有提取樣品中未檢測(cè)到山柰酚。結(jié)果表明，木薯葉片中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)以黃酮苷類(lèi)蘆丁和煙花苷為主。

2.1.2 料液比的影響 在0.2 g木薯粉末中，分別加入5～30 mL 40 %的乙醇溶液。在70 ℃條件下超聲提取30 min，考察料液比對(duì)黃酮醇物質(zhì)提取效果的影響。如圖2所示，隨著提取溶劑體積的增加，檢測(cè)到3種黃酮醇物質(zhì)，雖然料液比為1∶75(g/mL)后槲皮素的含量差異不顯著，但根據(jù)3種黃酮醇含量最大值顯示，在料液比為1∶75(g/mL)時(shí)，蘆丁、煙花苷和槲皮素提取量時(shí)達(dá)到最高，含量分別為5233.9、1039.9和11.2 μg/g。因此選擇料液比1∶75提取木薯葉中3種黃酮醇物質(zhì)會(huì)更佳，使用溶劑相對(duì)較少。

圖2 不同料液比對(duì)黃酮醇提取效果的影響Fig.2 Effect of liquid/solid on the extracting flavonols from cassava leaves

圖3 標(biāo)準(zhǔn)樣品和加標(biāo)樣品中黃酮醇物質(zhì)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of flavonols in standard and sample

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在200～600 nm范圍內(nèi)對(duì)蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚的混合標(biāo)樣溶液進(jìn)行紫外掃描，4種黃酮醇物質(zhì)在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)有兩個(gè)特征吸收高峰，最大吸收峰分別在356、348、372和366 nm。因此，實(shí)驗(yàn)選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，參比波長(zhǎng)設(shè)為450 nm。同時(shí)，為了獲得4個(gè)物質(zhì)的最佳分離效果，在文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上[14]，對(duì)流動(dòng)相比例和磷酸水溶液的酸度進(jìn)行調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，利用0.2 %的磷酸水溶液進(jìn)行樣品的分析，蘆丁和煙花苷在樣品中出峰不拖尾，峰形較好。如圖4所示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚的保留時(shí)間分別為8.305、10.792、14.925和19.164 min，加標(biāo)樣品中4種黃酮醇物質(zhì)出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品一致。

2.3 方法的線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

如表1所示，4種黃酮醇的線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)分別達(dá)到了0.9996、0.9999、0.9992和0.9995。以標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)?倍信噪比(S/N)，確定四種黃酮醇物質(zhì)的檢出限(LOD)分別為0.10和0.10、0.04和0.02 μg /mL。

2.4 儀器精密度

以蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以4種黃酮醇的響應(yīng)值變化，考察該儀器的精密度，四種黃酮醇物質(zhì)的平均峰面積分別為2511.8、396.2、19.9和16.3 mV，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.01 %、0.14 %、0.63 %和3.12 %。說(shuō)明該儀器精密度良好。

2.5 方法重復(fù)性

選擇一個(gè)加標(biāo)樣品，重復(fù)進(jìn)樣5次，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚平均峰面積分別為7132.59、1637.09、784.12、1018.95 mV，峰面積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.33 %、2.12 %、1.36 %和1.32 %，表明該檢測(cè)方法的重復(fù)性較好。

2.6 樣品穩(wěn)定性

24 h內(nèi)6次進(jìn)樣分析(表2)顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚平均質(zhì)量濃度分別為6791.7、1654.1、101.4和71.4 μg/g，濃度變化的RSD分別為0.11 %、0.40 %、1.92 %和1.72 %，樣品中的4種黃酮醇含量變化<2.00 %，表明24 h內(nèi)樣品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚穩(wěn)定性較好。

2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(表3)表明，蘆丁的回收率在90.81 %～99.90 %，平均回收率為98.47 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.84 %；煙花苷的回收率在88.35 %～92.76 %，平均回收率為90.81 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.25 %；槲皮素的回收率在93.57 %～98.27 %，平均回收率為96.55 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6 %；山柰酚的回收率在98.57 %～100.6 %，平均回收率為99.83 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1 %；表明本方法的準(zhǔn)確度較高，能夠滿(mǎn)足樣品測(cè)定需要。

表1 黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的線(xiàn)性、檢出限

表2 木薯樣品中黃酮醇的的穩(wěn)定性

表3 樣品中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

注： “-” 表示未檢測(cè)到。

Note: ‘-’， Not detect.

2.8 不同品種木薯葉片中黃酮醇物質(zhì)的檢測(cè)

利用已建立的提取和檢測(cè)方法，考察了三個(gè)木薯品種不同生育期木薯葉片中黃酮醇含量。數(shù)據(jù)分析表明(表4)，3個(gè)品種不同生育期的木薯葉片中，蘆丁、煙花苷和槲皮素在嫩葉期含量最高，熱引1號(hào)中含量分別為7503.4、8330.1和9.4 μg/g，SC09中含量分別為10 155.9、4992.8和9.1 μg/g；SC12中僅檢測(cè)到蘆丁和煙花苷，含量分別為4298.2、6171.7 μg/g。不同品種木薯葉片中3種黃酮醇總含量都呈現(xiàn)：嫩葉>成熟葉>幼葉的趨勢(shì)；熱引1號(hào)、SC09和SC12 3個(gè)品種嫩葉期黃酮醇總量分別為15 843 μg/g、15 157.8和10 460.9 μg/g。在考察的品種中，嫩葉期的黃酮醇類(lèi)物質(zhì)總含量最高為熱引1號(hào)；蘆丁含量最高為SC09；煙花苷含量最高為熱引1號(hào)。不同品種、不同生育期木薯葉片中黃酮醇含量差異較大，黃酮類(lèi)物質(zhì)在木薯葉中主要以糖苷類(lèi)物質(zhì)蘆丁和煙花苷存在，槲皮素微量或檢測(cè)不到，而山奈酚在考察的品種中都未檢測(cè)到。證明該方法能準(zhǔn)確的對(duì)不同品種木薯葉片中黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

3 討 論

木薯葉中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的提取方式很多，提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。有機(jī)溶劑提取時(shí)間較長(zhǎng)[11]，溶劑用量也大；堿提取法[9]雖然可以去除樣品中的氰化物，但提取率不高；減壓法[4]提取效果比超聲效果好，但是效率不高，操作繁瑣；超聲提取是目前天然產(chǎn)物提取常用的方法[10]，該方法具有省時(shí)、節(jié)能，可避免常規(guī)提取法對(duì)熱敏性物質(zhì)的破壞，溶劑用量也少，能在短時(shí)間能進(jìn)行大量樣品的提取。本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取30 min，可有效提取木薯葉片中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)。甲醇和乙醇是常用的黃酮類(lèi)化合物提取溶劑，高濃度的醇適宜于提取苷元，50 %左右的乙醇或甲醇水溶液適宜提取苷類(lèi)[13]，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)蘆丁和煙花苷在乙醇比例40 %～50 %提取效果最好，而槲皮素和山柰酚在乙醇比例為70 %～80 %時(shí)提取效果較好。陶海騰等的研究表明，黃酮物質(zhì)的提取率受乙醇濃度和料液比影響較大，受提取溫度和時(shí)間影響較小，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)乙醇濃度和料液比提取效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，料液比越高，越有利于黃酮醇物質(zhì)的提取，但料液比越高，損耗的提取溶劑就越多，因此，考慮不同成分的提取效率的情況下，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇了40 %和80 %乙醇水溶液，料液比1∶75(g /mL)，分別對(duì)苷類(lèi)(蘆丁和煙花苷)和苷元(槲皮素和山奈酚)進(jìn)行提取檢測(cè)，而提取溫度選擇黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的常用溫度70 ℃[10]。

表4 不同品種木薯葉片中黃酮醇含量

注： “-” 表示未檢測(cè)到。

Note: ‘-’， Not detect.

何翠薇等利用高效液相色譜技術(shù)，利用甲醇-0.1 %或0.4 %的磷酸水溶液等度洗脫的方法，對(duì)不同采收期木薯葉片中蘆丁的含量進(jìn)行了定量分析[4, 12]。本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)流動(dòng)相和洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相以甲醇-0.2 %的磷酸水溶液梯度洗脫22 min，可實(shí)現(xiàn)4種黃酮醇的基線(xiàn)分離；通過(guò)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加標(biāo)回收試驗(yàn)等方法學(xué)考察，證明該方法簡(jiǎn)便、可行，可以實(shí)現(xiàn)了蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚4種黃酮醇物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)。

此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)不同品種和生育期木薯葉進(jìn)行樣品驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)木薯中含有大量的蘆丁和煙花苷，少量的槲皮素；不同品種不同生育期的木薯葉片黃酮醇物質(zhì)含量差異較大；同時(shí)，結(jié)果驗(yàn)證了木薯葉中黃酮類(lèi)物質(zhì)差異與采收期、品種等有關(guān)[12, 14]，并且發(fā)現(xiàn)不同品種的木薯葉，嫩葉期3種黃酮醇物質(zhì)含量最高，研究結(jié)果將為木薯葉黃酮類(lèi)物質(zhì)的利用提供參考。

4 結(jié) 論

以40 %和80 %的乙醇水溶液，在料液比為1/75(g/mL)條件下，可快速有效提取木薯中4種黃酮醇物質(zhì)，利用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱，以甲醇—0.2 %磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，22 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)4種黃酮醇物質(zhì)的有效分離。通過(guò)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性與加標(biāo)回收試驗(yàn)等證明， 該方法準(zhǔn)確度、 精密度、 重復(fù)性較好， 能滿(mǎn)足不同木薯品種葉片中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山奈酚含量的同時(shí)測(cè)定，該方法可作為木薯葉黃酮醇物質(zhì)含量的測(cè)定方法。