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N-乙酰半胱氨酸對(duì)槲皮素穩(wěn)定性的影響及兩者聯(lián)合抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

2020-07-08 07:08王立峰姚軼俊李枝芳王海鷗
中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2020年6期
關(guān)鍵詞:槲皮素抑制率培養(yǎng)液

王立峰 陳 琳 姚軼俊 李枝芳 王海鷗

(1 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心 南京210023 2 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院 南京211171)

槲皮素從洋蔥、蘋(píng)果、苦蕎、綠茶等食物中獲得[1-4],是最常見(jiàn)的膳食類(lèi)黃酮之一,同時(shí)具有優(yōu)異的抗腫瘤活性[5-6],因此,把槲皮素開(kāi)發(fā)成高效的天然抗腫瘤藥物具有重大意義。 雖然槲皮素的抗腫瘤活性顯著,但是,槲皮素的化學(xué)不穩(wěn)定性和水溶性差的特點(diǎn)還是明顯限制了槲皮素的生物利用率[7-8]。

N-乙酰半胱氨酸(NAC)具有良好的水溶性和抗氧化活性[9-10],在食品領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用前景。 NAC 具有還原性巰基,可以中和未成對(duì)的電子,發(fā)揮高效的抗氧化作用[11]。有研究表明NAC可作為玉米油在儲(chǔ)藏烹飪油炸過(guò)程中的抗氧化劑,并且其抗氧化作用效果要強(qiáng)于BHA[12]。 NAC還可抑制果汁的褐變和有害揮發(fā)物呋喃酮、 聚乙烯乙二醇的產(chǎn)生[13]。此外,NAC 還可作為多種產(chǎn)品的穩(wěn)定劑,例如:冰淇淋、調(diào)味醬、果醬、稀奶油、蛋黃醬、番茄沙司等。

本研究基于槲皮素易被氧化和NAC 具有優(yōu)異抗氧化能力的特點(diǎn),首先考察NAC 對(duì)槲皮素在細(xì)胞培養(yǎng)液中穩(wěn)定性的影響, 其次評(píng)價(jià)槲皮素與NAC 對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞、Caco-2結(jié)腸腺癌細(xì)胞、MKN-28 胃癌細(xì)胞和MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞的聯(lián)合抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素, 美國(guó)sigma 公司;N-乙酰半胱氨酸,上海碧云天生物技術(shù)公司;甲醇,德國(guó)默克公司;HepG-2 肝癌細(xì)胞、MKN-28 胃癌細(xì)胞、MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞、Caco-2 結(jié)腸腺癌細(xì)胞,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);MEM 培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液,美國(guó)Gibico 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2e 多功能酶標(biāo)儀, 美國(guó)分子儀器公司;BB15 CO2培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo Fisher 公司;Agilent 1100 高效液相色譜、Agilent 1100 DAD檢測(cè)器、Agilent 1100 四元泵、Agilent SBC18 分析柱(5 μm,4.6 mm × 250 mm),美國(guó)Agilent 公司;FRQ-1006TH 小型超聲波清洗機(jī), 杭州法蘭特超聲波科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制

1)槲皮素儲(chǔ)備液的配置 準(zhǔn)確稱(chēng)取槲皮素30.20 mg, 溶于1 mL 的DMSO 中,-20 ℃密封儲(chǔ)存。

2)NAC 儲(chǔ)備液的配置 準(zhǔn)確稱(chēng)取NAC 粉末81.60 mg,溶于1 mL 的PBS 溶液中,-20 ℃密封儲(chǔ)存。

1.3.2 槲皮素含量的測(cè)定 用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定槲皮素在培養(yǎng)液中的濃度。

1)樣品的制備 將槲皮素儲(chǔ)備液用培養(yǎng)液稀釋至50,100,150,200,250 μmol/L,或用分別含1,2,3,4,5 mmol/L NAC 的培養(yǎng)液將槲皮素儲(chǔ)備液稀釋至200 μmol/L,置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)中降解,分別于0,0.5,2,4,6,8,10,12,14 h 取樣,用HPLC 測(cè)定槲皮素的濃度。 培養(yǎng)液:DMEM 培養(yǎng)基+0.1%青霉素-鏈霉素溶液+10%胎牛血清。

2)高效液相色譜條件 A 相:超純水,B 相:甲醇;等度洗脫:23%A+77%B (15 min);檢測(cè)波長(zhǎng)380 nm, 進(jìn)樣量10 μL, 柱溫30 ℃, 流速0.8 mL/min。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 30.20 mg 槲皮素用甲醇分別稀釋至50,100,150,200,250 μmol/L。 以槲皮素濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸, 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:Y=31.178X+21.02,R2=0.9906。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定 槲皮素和NAC用培養(yǎng)液配制成表1 所示的聯(lián)合濃度備用,DMSO終濃度均定容到體積分?jǐn)?shù)0.4%。 將HepG-2、MKN-28、MDA-MB-231 和Caco-2 細(xì)胞分別鋪于96 孔板上,培養(yǎng)過(guò)夜后,將原培養(yǎng)液棄去,分別加入表1 所示的不同系列培養(yǎng)液200 μL,對(duì)照組為僅含0.4%的DMSO 培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)液棄去, 用PBS 清洗2 次。 每孔加入120 μL 的1 mg/mL 的MTT 溶液,培養(yǎng)4 h,棄去MTT 溶液,每孔加入100 μL DMSO,37 ℃振蕩20 min,570 nm處測(cè)吸光度。HepG-2,Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)液:DMEM培養(yǎng)基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-鏈霉素;NKN-28 細(xì)胞培養(yǎng)液:1640 培養(yǎng)基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-鏈霉素;MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)液:MEM 培養(yǎng)基+10%的胎牛血清+0.1%的青霉素-鏈霉素。

表1 槲皮素(Que)和NAC 的聯(lián)合作用濃度Table 1 The combined treatment concentration of quercetin (Que)and NAC

細(xì)胞增殖抑制率的計(jì)算公式:

式中:A1——對(duì)照組的吸光度;A2——試驗(yàn)組的吸光度。

1.3.4 半數(shù)抑制濃度(IC50)和聯(lián)合指數(shù)(CI)的計(jì)算 利用軟件Graphpad Prism 8 擬合計(jì)算槲皮素、NAC 單獨(dú)作用時(shí)的IC50(24 h)值,以及同一濃度NAC 與不同濃度槲皮素聯(lián)用時(shí), 槲皮素的IC50值。 按公式(2)計(jì)算CI 值,以評(píng)價(jià)槲皮素和NAC的聯(lián)合抗腫瘤活性。 CI 值公式如下[14]:

式中:IC50(1)和IC50(2)分別為藥物1 和藥物2 單獨(dú)作用時(shí)的半數(shù)細(xì)胞增殖抑制效果所對(duì)應(yīng)的濃度;IC50(C1)和IC50(C2)分別為兩藥物聯(lián)用時(shí),產(chǎn)生半數(shù)增殖抑制效果時(shí)藥物1 和藥物2 所對(duì)應(yīng)的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,每組試驗(yàn)重復(fù)至少3 次;差異顯著水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素降解動(dòng)力學(xué)特征

由圖1 可知, 初始濃度不同的槲皮素在培養(yǎng)液中的濃度Ct隨時(shí)間t 都呈指數(shù)下降趨勢(shì)。因此,考慮將試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行零級(jí),一級(jí),二級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程擬合, 結(jié)果表明槲皮素的降解符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)特征。 因此,槲皮素(Que)的降解過(guò)程可作如下解釋?zhuān)?/p>

降解速率方程微分形式為:

用Ct替代Ct(Que),化簡(jiǎn)為:

公式4 不定式積分:

將lnCt對(duì)時(shí)間t 作直線(xiàn)圖,斜率為-kobs,這是一級(jí)反應(yīng)方程的重要特征,再對(duì)公式(5)作定積分,可得公式6:

積分可得公式7:

槲皮素的初始濃度C0和降解時(shí)間t 下的濃度Ct可以計(jì)算出kobs(表觀速率常數(shù)),并用公式(7)將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,結(jié)果表明ln(Ct/C0)與t 之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系(R2>0.98)(表2),所以具有不同初始濃度的槲皮素, 它的降解均符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)特征。

圖1 槲皮素在培養(yǎng)液中的濃度隨時(shí)間變化散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot of change in concentration of quercetin in medium over time

圖2 可知,當(dāng)槲皮素的初始濃度從50 μmol/L增加到250 μmol/L,kobs并不會(huì)隨著槲皮素初始濃度的增加而發(fā)生顯著變化, 這是一級(jí)降解反應(yīng)的又一個(gè)重要特征[15]。 由此可知,槲皮素的降解半衰期與其初始濃度無(wú)關(guān),只與kobs相關(guān)。因此,槲皮素在培養(yǎng)液中的降解是恒定的,如何減小kobs是提高槲皮素穩(wěn)定性的關(guān)鍵所在。

2.2 NAC 對(duì)槲皮素降解速率的影響

從圖3 可知,在含有不同濃度NAC 的培養(yǎng)液中, 槲皮素的濃度Ct隨時(shí)間t 依舊呈指數(shù)下降變化,進(jìn)一步擬合圖3 的數(shù)據(jù),得到一級(jí)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(圖4),其相關(guān)系數(shù)均大于0.95(表3),所以ln(Ct/C0)和時(shí)間t 之間存在較好的線(xiàn)性關(guān)系。因此,槲皮素在不同NAC 濃度條件下的降解仍符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)特征。

從圖5 可知,在不含NAC 的培養(yǎng)液中,槲皮素的kobs為(0.9434 ± 0.072)h-1,而在含1 mmol/L NAC 的培養(yǎng)液中,槲皮素的kobs減小為(0.5021 ±0.051)h-1, 并且NAC 濃度越高, 槲皮素的kobs越小。當(dāng)NAC 的濃度達(dá)到5 mmol/L 時(shí),槲皮素的kobs則減小為(0.1711 ± 0.029)h-1,降解時(shí)間也從4 h延長(zhǎng)到了16 h。 所以,NAC 能減小槲皮素在培養(yǎng)液中的降解速率, 提高槲皮素在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性。

圖2 初始濃度對(duì)槲皮素在培養(yǎng)液中降解速率的影響Fig.2 Effect of initial concentration on degradation rate of quercetin in culture medium

表2 不同初始濃度槲皮素(Que)在培養(yǎng)中降解的線(xiàn)性回歸決定系數(shù)(R2)Table 2 Linear regression coefficient of determination (R2)of different initial concentrations of quercetin (Que)in the culture medium

表3 槲皮素(Que)在含NAC 培養(yǎng)液中降解的線(xiàn)性回歸決定系數(shù)(R2)Table 3 Linear regression coefficient of determination (R2)of quercetin (Que)in cultrue medium containing NAC

圖3 槲皮素在含NAC 的培養(yǎng)液中的濃度隨時(shí)間變化散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter plot of change in concentration of quercetin in culture medium containing NAC over time

圖4 槲皮素在含NAC 的培養(yǎng)液中的一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.4 First-order plots for degradation of quercetin in culture medium containing NAC

圖5 NAC 濃度對(duì)槲皮素降解速率的影響Fig.5 The effect of NAC on the degradation rate of quercetin in the medium

細(xì)胞培養(yǎng)液模擬細(xì)胞在體內(nèi)生存的生理環(huán)境,是維護(hù)組織細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)各項(xiàng)操作過(guò)程中所需的基本溶液,包含細(xì)胞所需的氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、維生素等物質(zhì)。研究表明,槲皮素在培養(yǎng)液中的降解速度大于在PBS 中的降解速度[16], 并且槲皮素在培養(yǎng)液中主要發(fā)生氧化降解[7,17]。 這是因?yàn)殚纹に谺 環(huán)的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)是良好的供氫體, 是活性自由基最先攻擊的部位[18];C 環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)(C2=C3,C4=O)也易被活性自由基進(jìn)攻,形成穩(wěn)定的槲皮素酚氧自由基離域[19];C 環(huán)3 位的-OH 則有助于槲皮素被氧化后形成更多共振結(jié)構(gòu)使其更加穩(wěn)定[20-21]。 抗壞血酸和半胱氨酸能有效抑制槲皮素在pH 8.0 的磷酸緩沖液中的分解[22]。NAC 作為一種強(qiáng)有效的抗氧化劑,可以通過(guò)提供H+離子,中和氧自由基發(fā)揮直接抗氧化作用[23],理論上也能抑制槲皮素的氧化降解。綜上,不管是理論還是實(shí)踐均表明,NAC能降低槲皮素的降解反應(yīng)速率,提高槲皮素在細(xì)胞培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性。

2.3 槲皮素與NAC 的聯(lián)合抗腫瘤活性

濃度搭配比例會(huì)影響兩化合物聯(lián)合作用的效果[24],圖6 給出了槲皮素與NAC 聯(lián)用對(duì)4 種細(xì)胞的增殖抑制作用, 不同于槲皮素的濃度單位為μmol/L,NAC 的濃度單位為mmol/L,則NAC 對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較低的毒性作用。當(dāng)NAC 的濃度小于等于5 mmol/L 時(shí),其對(duì)4 種腫瘤細(xì)胞幾乎沒(méi)有產(chǎn)生毒性作用(細(xì)胞增殖抑制率小于10%)。 5 mmol/L NAC 對(duì)Caco-2、HepG-2、MKN-28 和MDAMB-231 細(xì)胞的增殖抑制率分別為2.14% ±0.56%,3.89%±0.37%,5.41%±0.73%和2.25% ±0.78%,100 μmol/L 槲皮素對(duì)Caco-2、HepG-2、MKN-28 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖抑制率分別為30.17% ± 3.16%,43.19% ± 4.23%,30.22% ±4.22%和15.27%±2.13%,但是5 mmol/L NAC 聯(lián)合100 μmol/L 槲皮素對(duì)Caco-2、HepG-2、MKN-28 和MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖抑制率分別增加至44.26% ± 3.41%,70.26% ± 4.88%,48.34% ±3.38%和22.76%±3.40%。因此,在NAC 不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi),NAC 能顯著提高槲皮素對(duì)4 種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性。

槲皮素聯(lián)合其它活性物質(zhì)的抗腫瘤活性研究已較為豐富, 槲皮素聯(lián)合山萘酚對(duì)人體腸癌細(xì)胞HuTu-80、Caco-2 和乳腺癌細(xì)胞PMC42 有協(xié)同抗增殖作用[25]。 槲皮素和10-羥基喜樹(shù)堿聯(lián)用對(duì)MCF-7、BGC-823 和HepG-2 腫瘤細(xì)胞均具有協(xié)同抗增殖作用[26]。 而槲皮素與NAC 的聯(lián)合抗腫瘤活性未見(jiàn)報(bào)導(dǎo),本研究首次對(duì)槲皮素與NAC 的聯(lián)合抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià), 結(jié)果表明槲皮素聯(lián)合NAC 能產(chǎn)生強(qiáng)于其各自作用時(shí)的抗腫瘤活性。

圖6 槲皮素(Que)聯(lián)合NAC 對(duì)Caco-2(a)、MKN-28(b)、HepG-2(c)、MDA-MB-231(d)4 種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,n=3)Fig.6 Antiproliferative effect of quercetin (Que)combined with NAC on Caco-2 (a),MKN-28 (b),HepG-2 (c), MDA-MB-231 (d)cancer cells (mean±SD, n=3)

表4 給出同一濃度NAC 與不同濃度槲皮素聯(lián)用時(shí),槲皮素的半數(shù)抑制濃度(IC50)和兩者的聯(lián)合指數(shù)(CI),隨著NAC 濃度的增加,槲皮素的IC50值呈快速下降的趨勢(shì)。 此外,槲皮素與NAC 的聯(lián)合指數(shù)都基本小于1,表現(xiàn)出良好的聯(lián)合效果,其中,槲皮素聯(lián)合NAC 對(duì)HepG-2 細(xì)胞的聯(lián)合指數(shù)CI 整體小于其它3 種細(xì)胞。 因此,在這4 種腫瘤細(xì)胞中,槲皮素聯(lián)合NAC 對(duì)HepG-2 細(xì)胞表現(xiàn)出最優(yōu)的抗腫瘤活性。

表4 NAC 聯(lián)合槲皮素(Que)作用24 h,槲皮素的半數(shù)抑制濃度(IC50)以及兩者的聯(lián)合指數(shù)(CI)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, n=3)Table 4 The IC50 of quercetin and combination index (CI)after cells treated with NAC combined with quercetin (Que)for 24 h (mean±SD, n=3)

3 結(jié)論

在不含NAC 的培養(yǎng)液中, 槲皮素的kobs為(0.9434±0.072)h-1,而當(dāng)培養(yǎng)液中的NAC 濃度從1 mmol/L 增加到5 mmol/L 時(shí), 槲皮素的kobs從(0.5021±0.051)h-1降低到 (0.1711 ±0.029)h-1。因此,NAC 能減小槲皮素在培養(yǎng)液中的降解速率,提高槲皮素在培養(yǎng)液中的穩(wěn)定性。 另一方面,由CI 值基本小于1 可知, 槲皮素聯(lián)合NAC 對(duì)HepG-2、Caco-2、MDA-MB-231 和MKN-28 4 種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出優(yōu)于其各自作用時(shí)的抗腫瘤活性,其中槲皮素聯(lián)合NAC 對(duì)HepG-2 細(xì)胞的抗腫瘤活性明顯高于其它3 種細(xì)胞。

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