趙謀明 焦 銘 林戀竹 歐蓉蓉

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510640）

脂肪氧合酶（LOX）是一種氧化還原酶，在動植物中廣泛存在。 植物源LOX 和動物源LOX 具有較高的氨基酸序列同源性。 具有十八碳結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸（例如亞油酸）是植物源LOX 的主要底物[1-3]。 目前我國大豆分離蛋白的生產(chǎn)能力已居全球首位， 然而， 脫脂豆粕中存在較高活性的LOX，在脫脂豆粕儲存過程中，LOX 能催化殘留的亞油酸緩慢發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)， 進(jìn)而導(dǎo)致大豆蛋白氧化，從而降低其熱穩(wěn)定性、凝膠強(qiáng)度和持水性[4-6]。 探尋有效干預(yù)LOX 催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白氧化的方法， 對于大豆制品品質(zhì)控制與提升十分重要。 植物多酚廣泛分布于蔬菜、水果、香辛料以及谷物中， 是植物體內(nèi)最重要的次生代謝產(chǎn)物之一[7]。 據(jù)報(bào)道，具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)單元的植物多酚，如槲皮素，具有很強(qiáng)的抗氧化以及與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力[8]。 采用植物多酚抑制LOX 活性，干預(yù)LOX 催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白氧化， 是切實(shí)有效的途徑[9-11]。 然而，目前鮮有關(guān)于植物多酚對LOX抑制作用機(jī)制的研究。

本文采用亞油酸-脂肪氧合酶（LOX）體系，研究4 種含鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的植物多酚（咖啡酸、綠原酸、兒茶素和槲皮素）對LOX 的抑制作用，基于Linweaver-Burk 作圖法及熒光光譜法明晰其作用機(jī)制，為通過調(diào)控LOX 活性來干預(yù)大豆蛋白氧化提供理論與方法的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；LUMINA 熒光分光光度計(jì)，美國Thermo 公司。

1.3 方法

1.3.1 植物多酚對LOX 的抑制活性測定[12]分別配制1.5 mmol/L 咖啡酸、綠原酸、兒茶素、槲皮素乙醇溶液，使用前用硼酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.0）稀釋至不同濃度。 在96 孔紫外板中分別加入不同濃度的多酚稀釋液50 μL，加入50 μL 用硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.0）稀釋好的LOX 溶液（11.33 U/mL），37 ℃孵育10 min， 加入150 μL 0.107 mol/L 亞油酸啟動反應(yīng)，立即在234 nm 波長下開始讀數(shù)，每10 s 讀一次，共計(jì)5 min，將所有讀數(shù)值對反應(yīng)時間作圖， 所繪直線斜率為LOX 活性（I多酚）。 以硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.0）代替多酚溶液，測定LOX 活性（I空白）。 試驗(yàn)重復(fù)3 次。多酚干預(yù)后，LOX 相對酶活的計(jì)算公式為：

IC50值為LOX 相對酶活為50%時多酚的濃度。

1.3.2 植物多酚對LOX 的抑制類型研究 采用1.3.1 節(jié)中LOX 抑制活性的測定方法，固定亞油酸濃度為0.15 mmol/L， 研究不同濃度的多酚溶液（終濃度分別為0，40，100，160，200 μmol/L）對不同濃度的LOX 溶液（質(zhì)量濃度分別為0，5.66，8.50，11.33，14.16，21.24 U/mL）的抑制作用。

在此基礎(chǔ)上，固定酶質(zhì)量濃度為11.33 U/mL，研究不同濃度多酚溶液 （終濃度分別為0，40，100，160，200 μmol/L）在不同濃度的亞油酸溶液（終濃度分別 為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mmol/L）條件下對LOX 的抑制作用， 采用Linweaver-Burk 作圖法判定多酚對LOX 的抑制類型。

1.3.3 植物多酚對LOX 內(nèi)源性熒光的影響[13]在比色皿中加入2 mL LOX（11.33 U/mL）溶液，分次滴加10 mmol/L 的多酚溶液，每次2 μL，使得多酚終濃度分別為0，10，20，30，40，50，60，70 μmol/L，混勻，靜置5 min 后，設(shè)定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長掃描范圍為290～500 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，整個過程保持在25 ℃條件下進(jìn)行，獲得熒光光譜。

1.3.4 植物多酚對LOX 構(gòu)象的影響[14]在比色皿中加入2 mL LOX（11.33 U/mL）溶液，分次滴加10 mmol/L 的多酚溶液，使得多酚終濃度分別為0，5，10，20，30，40，50 μmol/L，混勻，靜置5 min 后，設(shè)定激發(fā)波長掃描范圍為250～330 nm，發(fā)射波長掃描波長范圍為265～345 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm， 獲得Δλ=15 nm 時LOX 的同步熒光光譜； 設(shè)定激發(fā)波長掃描范圍為250～310 nm，發(fā)射波長掃描波長范圍為310～370 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm， 獲得Δλ=60 nm 時LOX 的同步熒光光譜。

運(yùn)用GEODA1.4.6對大連市主城區(qū)房價(jià)進(jìn)行局域空間自相關(guān)研究，得出莫蘭指數(shù)值為0.42，z得分較高為15.0，p值較低為0，說明大連市主城區(qū)的房價(jià)在空間上布局為集聚，具有較明顯的空間正相關(guān)，也就是價(jià)格高/高或低/低集聚。

1.3.5 植物多酚交互作用對LOX 活力的影響[15]采用1.3.1 節(jié)中LOX 抑制活性的測定方法，分別研究植物多酚在不同濃度下兩兩復(fù)合時LOX的活力，探究植物多酚交互作用對LOX 活力的影響。Va和Vb分別表示兩種不同植物多酚分別作用時LOX 的活力，Vab表示植物多酚兩兩復(fù)合時LOX 的活力，Vc=Va×Vb。 當(dāng)植物多酚兩兩之間存在協(xié)同作用（synergistic，SY），則Vab-Vc<-0.10；當(dāng)植物多酚兩兩之間存在相加作用（additive，AD），則-0.100.10。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0 軟件中的ANOVA 方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)分析，以P<0.05 為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物多酚對LOX 活力抑制作用

據(jù)報(bào)道， 植物多酚具有良好的LOX 抑制活性，酚羥基的數(shù)目與位置對植物多酚的LOX 抑制活性具有顯著性影響[16]。 本文選取含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的植物多酚（咖啡酸、綠原酸、兒茶素和槲皮素），研究其對LOX 抑制作用（圖1）。

圖1 植物多酚對LOX 活力的影響Fig.1 Effect of selected phenolics on LOX activities

研究結(jié)果表明：LOX 活力隨著多酚濃度增大逐漸降低。 植物多酚濃度越高，對LOX 活力抑制作用越強(qiáng)，表明植物多酚對LOX 抑制活性呈劑量依賴關(guān)系。4 種多酚對LOX 活力的抑制作用，從強(qiáng)到弱依次為槲皮素 （IC50=127.21 μmol/L）>兒茶素（IC50=143.34 μmol/L）>咖啡酸 （IC50=165.51 μmol/L）>綠原酸（IC50=179.70 μmol/L）。

2.2 植物多酚對LOX 的抑制類型

植物多酚對LOX 活力抑制的v-[LOX]曲線如圖2 所示。 結(jié)果表明：酶促反應(yīng)速率（v）隨酶濃度增加而逐漸增加，且隨多酚濃度增加而逐漸減小。不同濃度植物多酚干預(yù)時，所繪制的v-[LOX]曲線是一簇通過原點(diǎn)的直線，說明咖啡酸、綠原酸、兒茶素和槲皮素對LOX 活力的抑制作用均為可逆性抑制作用[17]。

圖2 植物多酚對LOX 活力抑制的v-[LOX]曲線Fig.2 Plots of velocity （v）versus [LOX] at different concentrations of phenolics

在此基礎(chǔ)上，以酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）對亞油酸濃度的倒數(shù)（1/[S]）做Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線，如圖3 所示。 不同濃度綠原酸作用下，以1/v 對1/[S]作圖，得到5 條斜率不同的直線，但5 條直線無相同交點(diǎn)。 不同濃度咖啡酸作用時，所得雙倒數(shù)曲線雖交于一點(diǎn)，但交點(diǎn)既不在1/v 軸，也不在1/[S]軸。說明綠原酸與咖啡酸為LOX 的混合型抑制劑。 不同濃度兒茶素/槲皮素作用時，所得雙倒數(shù)曲線均在1/[S]軸交于一點(diǎn)，說明兒茶素/槲皮素濃度的增加不影響米氏常數(shù)（Km），提示兒茶素與槲皮素是LOX 的非競爭性抑制劑。Jameson等[18]研究表明：富含咖啡酸和綠原酸的綠咖啡豆經(jīng)過消化吸收后是LOX 的混合抑制劑。

當(dāng)多酚為LOX 的混合型抑制劑時，米氏方程可變換為：

v——酶促反應(yīng)速率，vmax——最大酶促反應(yīng)速率；Km——米氏常數(shù)/μmol·L-1；Ki——抑制常數(shù)/μmol·L-1；α——混合型抑制作用的變換系數(shù)；[I]——多酚濃度/μmol·L-1；[S]——LOX 濃 度/U·mL-1。

圖3 植物多酚對LOX 活力抑制的Lineweaver-Burk 曲線Fig.3 Lineweaver-Burk plots for LOX inhibition types of selected phenolics

綠原酸、咖啡酸、兒茶素和槲皮素對LOX 的抑制常數(shù)Ki和變換系數(shù)α 如表1 所示。 當(dāng)α=1時，多酚是LOX 的非競爭性抑制劑；當(dāng)α=∞時，多酚是LOX 的競爭性抑制劑； 當(dāng)0<α<1 時，多酚是LOX 的以非競爭性抑制為主導(dǎo)的競爭-非競爭性混合型抑制劑；當(dāng)α>1 時，多酚是LOX 的以競爭性抑制為主導(dǎo)的競爭-非競爭性混合型抑制劑[19-20]。 如表1 所示，綠原酸與咖啡酸是LOX 的以非競爭性抑制為主導(dǎo)的競爭-非競爭性混合型抑制劑， 綠原酸/咖啡酸可與LOX 活性中心結(jié)合，也可與LOX 非活性中心結(jié)合， 還可與LOX-亞油酸復(fù)合物結(jié)合， 但綠原酸/咖啡酸對LOX-亞油酸復(fù)合物的親和力強(qiáng)于綠原酸/咖啡酸對LOX 的親和力。4 種多酚對LOX 的抑制常數(shù)Ki從高到低依次為：綠原酸>咖啡酸>槲皮素>兒茶素，說明兒茶素對LOX 的親和力最強(qiáng)，其次為槲皮素，再次是咖啡酸，最后是綠原酸。

表1 4 種多酚對LOX 的抑制常數(shù)Ki、變換系數(shù)α、猝滅常數(shù)KSV、結(jié)合常數(shù)Ka 和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 1 Inhibition constant Ki， transform coefficient α， quenching constants KSV， binding constants Ka and number of binding sites n of selected phenolics on LOX

2.3 植物多酚對LOX 內(nèi)源性熒光的影響

蛋白分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸， 尤其以色氨酸熒光強(qiáng)度最大，因此，常將其作為內(nèi)源性熒光探針。 隨多酚濃度增加，LOX 內(nèi)源性熒光強(qiáng)度逐漸減弱（數(shù)據(jù)未顯示）， 說明4 種多酚均能與LOX 結(jié)合， 導(dǎo)致LOX內(nèi)源性的熒光猝滅。

以F0/F 對[Q]得到Stern-Volmer 曲線（數(shù)據(jù)未顯示）， 曲線不呈線性且呈現(xiàn)彎曲向上的趨勢，說明靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅同時存在于多酚與LOX相互作用過程中[21]。 采用改進(jìn)后的Stern-Volmer方程分別研究4 種多酚與LOX 相互作用時的動態(tài)猝滅常數(shù)KSV（表1）：

式中，F(xiàn)0——未加入多酚時LOX 的熒光強(qiáng)度；F——加入多酚時LOX 的熒光強(qiáng)度；f——多酚對發(fā)色基團(tuán)的可及分?jǐn)?shù)；[Q]——多酚濃度/μmol·L-1。

采用以下方程分別研究4 種多酚與LOX 相互作用時的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（表1）：

結(jié)果表明：4 種多酚對LOX 的猝滅常數(shù)KSV從大到小， 依次為槲皮素>兒茶素>咖啡酸>綠原酸， 說明槲皮素與兒茶素相對于咖啡酸與綠原酸更易與LOX 中色氨酸、 酪氨酸以及苯丙氨酸結(jié)合， 導(dǎo)致熒光猝滅。 4 種多酚與LOX 的結(jié)合常數(shù)Ka從大到小， 依次為槲皮素>兒茶素>綠原酸>咖啡酸， 說明植物多酚既可與能發(fā)射熒光的氨基酸結(jié)合，也可與不能發(fā)射熒光的氨基酸結(jié)合。 此外，多酚-LOX 相互作用可能會改變LOX 構(gòu)象， 導(dǎo)致其內(nèi)源性熒光變化[22]。 4 種多酚與LOX 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均大于1， 說明它們可以與LOX 進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合[23]。4 種多酚對LOX 活力的抑制作用，從強(qiáng)到弱依次為槲皮素>兒茶素>咖啡酸>綠原酸，說明多酚對LOX 的抑制活性不僅取決于多酚與LOX 的親和力強(qiáng)弱，還取決于多酚與LOX 的結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 植物多酚對LOX 構(gòu)象的影響

Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 所得同步熒光光譜分別表示酪氨酸、色氨酸殘基的光譜特性[24]。 酪氨酸、 色氨酸殘基所處微環(huán)境的親疏水性變化可用以表征多酚對酶構(gòu)象的影響。多酚干預(yù)后，LOX 在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 時的同步熒光光譜如圖4所示。

圖4 多酚對LOX 在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 時的同步熒光光譜的影響及對LOX 最大熒光吸收峰熒光強(qiáng)度的F/F0-[Q]曲線Fig.4 The synchronous fluorescence spectra of LOX and the corresponding intensity changes of the maximum emission peak plotted as F/F0-[Q] plots in the presence of （a）chlorogenic acid， （b）caffeic acid， （c）catechinic，（d）quercetin at Δλ=15 nm and Δλ=60 nm

如圖4a 所示， 隨著綠原酸濃度的增加，當(dāng)Δλ=15 nm 時，LOX 最大吸收波長從315 nm 藍(lán)移至305 nm， 酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；當(dāng)Δλ=60 nm 時，LOX 最大吸收波長從343 nm 藍(lán)移至340 nm，色氨酸所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；如圖4b 所示，隨著咖啡酸濃度的增加，當(dāng)Δλ=15 nm 時，LOX 最大吸收波長從315 nm 藍(lán)移至305 nm，酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；當(dāng)Δλ=60 nm 時，LOX 最大吸收波長從344 nm 藍(lán)移至340 nm，色氨酸所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；隨著綠原酸/咖啡酸濃度的增加，Δλ=15 nm 時F/F0對[Q]所繪制的曲線斜率大于Δλ=60 nm 時， 說明綠原酸/咖啡酸與LOX 的結(jié)合位點(diǎn)離酪氨酸殘基更近[25]；如圖4c，隨著兒茶素濃度的增加，當(dāng)Δλ=15 nm 時，LOX最大吸收波長從315 nm 藍(lán)移至305 nm，酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；當(dāng)Δλ=60 nm 時，LOX 最大吸收波長從343 nm 藍(lán)移至340 nm，說明色氨酸所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；Δλ=15 nm 時F/F0對[Q]所繪制的曲線斜率和Δλ=60 nm 時差別不大， 說明兒茶素與LOX 的結(jié)合位點(diǎn)與酪氨酸、色氨酸殘基距離相差不大。如圖4d，隨著槲皮素濃度的增加，當(dāng)Δλ=15 nm 時，LOX 最大吸收波長從315 nm 藍(lán)移至305 nm，酪氨酸殘基所處微環(huán)境的極性降低，疏水性增加；當(dāng)Δλ=60 nm 時，LOX 最大吸收波長從343 nm 紅移至350 nm， 說明色氨酸所處微環(huán)境的極性增加，疏水性隨著槲皮素濃度的增加而降低；Δλ=60 nm時F/F0對[Q]所繪制的曲線斜率大于Δλ=15 nm時，說明槲皮素與LOX 的結(jié)合位點(diǎn)離色氨酸殘基更近。

2.5 兒茶素和槲皮素的交互作用對LOX 活力的影響

本文探討了具有強(qiáng)LOX 抑制活性的兩種黃酮類化合物（兒茶素和槲皮素）的交互作用對LOX抑制活力的影響，結(jié)果如表2 所示。

結(jié)果表明： 低濃度的兒茶素和槲皮素兩兩復(fù)合時，呈現(xiàn)協(xié)同作用；高濃度的兒茶素和槲皮素兩兩復(fù)合時，呈現(xiàn)相加作用。 槲皮素是強(qiáng)LOX 抑制劑，可與LOX 非活性中心高效結(jié)合，改變LOX 分子構(gòu)象，更有利于兒茶素與LOX 結(jié)合，因此低濃度時，兩種黃酮呈現(xiàn)協(xié)同作用；兒茶素和槲皮素均可有效抑制LOX 活力， 均與LOX 的非活性中心有較強(qiáng)的親和力， 可與其進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合， 高濃度時， 兒茶素/槲皮素會競爭性地占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，兩種黃酮呈現(xiàn)相加作用。

表2 兒茶素和槲皮素交互作用對LOX 活力的影響Table 2 Interactions of catechin with quercetin on LOX

3 結(jié)論

含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物（兒茶素和槲皮素）對LOX 的抑制作用強(qiáng)于酚酸類化合物（綠原酸和咖啡酸）。 兒茶素與槲皮素是LOX 的非競爭型抑制劑，綠原酸與咖啡酸是LOX 的以非競爭性抑制為主導(dǎo)的競爭-非競爭性混合型抑制劑。多酚對LOX 的抑制活性不僅取決于多酚與LOX的親和力強(qiáng)弱， 還取決于多酚與LOX 的結(jié)合位點(diǎn)。低濃度的兒茶素和槲皮素兩兩復(fù)合時，呈現(xiàn)協(xié)同作用，可高效調(diào)控LOX 活性來干預(yù)大豆蛋白氧化。