王慶峰，姜昕，馬鳴超，關(guān)大偉，趙百鎖，魏丹，曹鳳明，李力，李俊

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081；2農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，北京100081；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，哈爾濱 150086）

0 引言

【研究意義】我國東北黑土帶是世界三大黑土帶之一，其養(yǎng)分豐富，有機(jī)質(zhì)含量高，是我國重要商品糧生產(chǎn)基地，以20%的耕地生產(chǎn)出全國30%的糧食，對我國糧食安全起著舉足輕重的作用。由于長期不合理施肥和耕作，東北黑土農(nóng)田質(zhì)量日益退化，包括存在土壤酸化、土壤養(yǎng)分發(fā)生變化、土層變薄以及土壤微生物活性降低等一系列問題[1]。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是土壤中重要微生物類群之一，廣泛分布于自然界土壤中，能夠與陸地上大約 80%的植物根系形成共生關(guān)系[2]。這種共生關(guān)系的維持一方面依賴于植物提供光合產(chǎn)物（主要是六碳糖）供AM真菌生長和代謝[3-4]，另一方面AM真菌能夠促進(jìn)植物對于土壤中營養(yǎng)元素的吸收（尤其是磷、氮元素），提高植物對于病原菌的抗性和抗干旱能力等[5-6]，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有重要作用[7]。因此，開展長期施肥條件下東北黑土中AM真菌群落組成研究，能為進(jìn)一步認(rèn)識AM真菌對化肥的響應(yīng)機(jī)制，以及改進(jìn)施肥和耕作制度提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明長期不合理農(nóng)藝措施（如長期過量不合理施肥）已經(jīng)使土壤中養(yǎng)分含量發(fā)生顯著改變[1,8]。郝小雨等[9]研究表明，長期施肥提高了土壤中全氮、可溶性有機(jī)氮等養(yǎng)分含量。丁建莉等[10]研究連續(xù)施肥長達(dá)36年的我國東北黑土發(fā)現(xiàn)，施用化肥或有機(jī)肥等顯著提高了土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、全氮等養(yǎng)分含量；養(yǎng)分含量變化將導(dǎo)致土壤中AM真菌和植物的共生關(guān)系發(fā)生改變。根據(jù)功能均衡模型理論（the functional equilibrium model），當(dāng)土壤中養(yǎng)分含量發(fā)生改變時，植物將光合作用產(chǎn)生的能量物質(zhì)分配給能夠給植物提供其他限制性物質(zhì)的物種[11]。張旭紅等[12]研究了黑龍江海倫長期定位培肥試驗地黑土中AM真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果表明隨著土壤肥力的提升，AM 真菌的豐度和密度均呈增加趨勢，而當(dāng)肥力提高到一定程度后土壤中AM真菌的豐度和密度開始下降。土壤中單施氮肥或磷肥能夠降低土壤中AM真菌數(shù)量、物種豐富度和多樣性[7,13-15]。另外，氮肥對 AM 真菌群落的影響受土壤中有效磷的影響，氮肥在磷缺乏時能夠提高土壤中AM真菌豐富度和多樣性，而在磷豐富時降低[16-17]。但是研究多集中在根內(nèi)AM真菌，而對土壤中AM真菌的涉及較少。CESARO等[18]的研究表明，土壤中AM真菌物種多樣性和豐度高于植物根內(nèi)，說明植物根內(nèi)AM真菌只是土壤AM真菌的一部分。另外，研究表明土壤中微生物受土壤環(huán)境因子的影響。如本課題組以東北黑土為研究對象，發(fā)現(xiàn)長期施用化肥降低了黑土中細(xì)菌和真菌的多樣性，改變了土壤中細(xì)菌和真菌的群落組成，影響東北黑土微生物群落結(jié)構(gòu)的主效環(huán)境因子是土壤pH[1,19]。楊海水等[20]綜述了影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響因素，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子，寄主植物以及土壤類型是影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。【本研究切入點】近年來，在國家日益重視東北黑土地保護(hù)的背景下，人們加快了對東北黑土的研究。與我國南方酸性紅壤相比，東北黑土的酸化是由長期施用化學(xué)肥料導(dǎo)致的，且土壤有機(jī)質(zhì)含量較高，由土壤提供的養(yǎng)分元素水平也較高。然而，長期施肥對肥沃的黑土中 AM 真菌群落組成的影響以及影響AM 真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選取5種不同施肥處理的黑土耕層土壤為研究對象，采用Illumina Miseq測序平臺，探討長期連續(xù)施用氮肥和氮、磷混施東北黑土AM真菌多樣性和群落組成的變化及其與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。本研究的開展有助于了解長期施肥條件下，土壤中AM真菌群落組成變化規(guī)律，為優(yōu)化該地區(qū)農(nóng)田施肥制度，提高土壤肥力，維護(hù)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗田位于黑龍江省哈爾濱市農(nóng)業(yè)部黑龍江耕地保育與農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測站（45°40′N，126°35′E），海拔151 m，年降水量533 mm，年平均氣溫3.5℃，屬松花江二級階地，地勢平坦，土壤類型為黑土。長期定位試驗從1980年起按小麥-大豆-玉米順序輪作，每年種植一季，到2016年為第37個生長季，小麥茬。本研究選擇5個處理：CK（不施肥處理），N1（單施常量氮肥），N1P1（混施常量氮肥和磷肥），N2（單施2倍常量氮肥），N2P2（混施2倍常量氮肥和磷肥）。各小區(qū)面積36 m2（9 m×4 m），氮、磷肥分別為尿素和重過磷酸鈣。氮、磷肥小麥和玉米季施用量為150 kg N·hm-2·a-1和 75 kg P2O5·hm-2·a-1。氮、磷肥大豆季施用量為 75 kg N·hm-2·a-1和 150 kg P2O5·hm-2·a-1。氮、磷肥均為秋施肥（玉米季氮肥50%秋施，50%于玉米大喇叭口期追施）。

1.2 樣品采集

土壤樣品采集于2016年6月29日（小麥正處于灌漿期），在無根區(qū)域采集0—20 cm的耕層土壤。每個小區(qū)隨機(jī)取10個點，充分混勻后作為該施肥處理的一個樣品，每個處理3個重復(fù)。試驗共采集15個樣品，每個樣品一部分于-80℃保存，用于分子生物學(xué)分析，一部分于室溫下風(fēng)干、研磨并過2.0 mm篩，用于土壤理化性質(zhì)的測定。

1.3 土壤理化指標(biāo)的測定

土壤pH參照魯如坤[21]的方法（土水比1:1）測定。土壤有機(jī)質(zhì)含量測定采用重鉻酸鉀容量法[22]，土壤全氮采用凱氏定氮法測定[22]，速效鉀采用乙酸銨浸提-原子吸收火焰光度法[1]，有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法[10]，硝態(tài)氮、銨態(tài)氮采用2 mol·L-1KCl浸提，然后利用流動分析儀測定。

1.4 土壤總DNA提取與高通量測序

總DNA提取采用Power Max Soil DNA Isolation Kit試劑盒（MOBIO，USA），每個樣品稱取0.25 g土壤，依照試劑盒說明書提取土壤總DNA。所提取的土壤總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性，Nano Drop測定DNA純度和濃度。15個樣品的AM真菌DNA采用巢式PCR擴(kuò)增。第一對引物包括LR1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GA-3′），F(xiàn)LR2（5′-GTC GTT TAA AGC CAT TAC GTC-3′）[23]；第二對引物包括FLR3（5′-TTG AAA GGG AAA CGA TTG AAG T-3′），PLR4（5′-TAC GTC AAC ATC CTT AAC GAA-3′）[24]。第二對引物包括接頭 A、B和樣品識別序列。兩輪 PCR擴(kuò)增體系都包括：5 μL 10×Pyrobest緩沖液，4 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上下游引物各 2 μL（10 μmol·L-1），0.75 U Pyrobest DNA聚合酶和30 ng模板DNA。擴(kuò)增條件參照前人研究方法[7]，兩輪擴(kuò)增條件均為 98℃預(yù)變性 5 min，98℃變性45 s，58℃退火50 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。制備Amplicon文庫后，應(yīng)用Illumina MiSeq PE250平臺進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

通過Illumnia Miseq平臺測序所得的下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件進(jìn)行質(zhì)量控制[7]。具體過程為：去除質(zhì)量值低于 20的序列；根據(jù)序列間的重復(fù)序列（overlap）將序列進(jìn)行拼接；去除引物序列，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫檢測并去除嵌合體，獲得高質(zhì)量序列。利用CROP軟件將核苷酸相似度大于97%的序列作為一個分類操作單元（OTU）[25]，利用GenBank數(shù)據(jù)庫對物種進(jìn)行注釋，并去除非AM真菌序列和所有處理中只有一條序列的OTU[26]，將所有樣品序列進(jìn)行抽平（Subsample）。根據(jù)不同AM真菌類群在該樣品所占的比例計算AM真菌類群相對豐度。利用Mothur軟件（V1.31.2）計算樣品α多樣性。

數(shù)據(jù)分析利用Excel 2010，SPSS 19.1和Conoco5.0軟件進(jìn)行。利用單因素方差分析（ANOVA，Tukey’s test）分析不同處理間理化性質(zhì)、α多樣性以及AM真菌相對豐度差異?；贐ray-Curtis相似距離，運用非度量多維度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）對東北黑土中AM真菌β多樣性進(jìn)行分析。采用R（v3.1.1）軟件包中的ANOSIM分析不同處理間AM真菌群落結(jié)構(gòu)的差異顯著性，并采用冗余分析（RDA）進(jìn)行土壤理化性質(zhì)和AM真菌群落組成的關(guān)系分析。

2 結(jié)果

2.1 長期施用氮、磷肥對土壤理化性質(zhì)的影響

連續(xù)施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著改變黑土理化性質(zhì)（表 1）。與對照（不施肥）相比，長期施肥顯著降低土壤 pH（P＜0.05），且隨著氮肥施用量的增加，pH降低幅度增加，特別是施2倍常量氮肥處理（N2和N2P2），pH分別降低至5.01和4.90，降低了1.83和1.94個單位。與對照處理相比，單施氮肥處理，土壤有效磷含量變化不顯著（P＞0.05），而氮、磷混施顯著提高土壤有效磷含量。長期施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著降低土壤速效鉀含量，提高土壤全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和土壤有機(jī)質(zhì)含量，特別是施用2倍常量氮肥處理，其全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著高于施常量氮肥處理和不施肥處理。

表1 不同施肥處理土壤理化性質(zhì)Table 1 Properties of soil samples under long-term fertilizer regimes

2.2 長期施用氮、磷肥對土壤AM真菌群落組成和多樣性的影響

通過高通量測序共產(chǎn)生238 113條高質(zhì)量序列，平均每個樣品含有15 874條，所有序列共歸為259個OTUs，其中128個OTUs是非AM真菌序列，非AM真菌的序列數(shù)僅占總序列的4.1%。所有樣品覆蓋度指數(shù)（good’s coverage value）在 97%相似度下均大于99%，說明測序深度已足夠評價該土壤AM真菌群落組成和多樣性。

在科水平上（圖1），主要AM菌包含4個科，分別為球囊霉科（Glomeraceae）（13.21%—64.53%）、Claroideoglomeraceae（2.66%—22.70%）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）（0.28%—29.65%）和類球囊霉科（Paraglomeraceae）（0.03%—3.47%）。ANOVA分析表明，長期施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著改變AM 真菌群落的組成。其中，長期氮、磷添加顯著降低Glomeraceae，且其豐度在單施氮肥處理比氮、磷肥混施處理豐度低；而單施氮肥處理的 Gigasporaceae和Paraglomeraceae相對豐度比氮、磷肥混施處理高；Claroideoglomeraceae相對豐度在 N1P1處理中較高，而其他處理低于對照。在屬水平上（圖2），主要AM菌包含7個屬，其中Rhizophagus和Septoglomus在各施肥處理間沒有顯著差異（圖2-e、圖2-f），而球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）和類球囊霉屬（Paraglomu）相對豐度在各處理間具有顯著差異。與對照處理相比，長期施肥降低了管柄囊霉屬（Funneliformis）和Septoglomus菌屬相對豐度，而提高了Paraglomu的相對豐度。同時，在氮肥基礎(chǔ)上添加磷肥對 AM真菌群落組成也具有顯著的影響，如Glomus和Funneliformis相對豐度在 N1P1和 N2P2處理中高于N1和N2處理；而Gigaspora和Paraglomu則表現(xiàn)出相反的特征。

長期施用氮肥以及氮、磷肥混施對AM真菌多樣性的影響見表2。長期單施氮肥對AM真菌多樣性指數(shù)（PD_whole_tree），豐富度指數(shù)（Chao1）以及OTUs數(shù)量影響不顯著（P＞0.05），說明長期單施氮肥對黑土中AM真菌多樣性影響不大。但是氮、磷混施（N1P1和N2P2）降低土壤中AM真菌多樣性，特別是N1P1處理顯著降低土壤中PD_whole_tree指數(shù)，

Chao1指數(shù)以及OTUs數(shù)量，其與對照相比，分別降低了16%、16%和15%（表2）。對不同氮、磷添加處理的AM真菌β多樣性分析結(jié)果如圖3所示，其中第一排序軸代表AM真菌38.54%群落組成變異，而第二排序軸代表AM真菌36.66%群落組成變異。施肥顯著改變AM真菌群落組成，其中N1和N2處理的群落組成較為接近，而 N1P1和 N2P2處理的群落結(jié)果較為接近。ANOSIM分析表明，各處理間AM真菌群落組成差異達(dá)到顯著水平（表 3），也再次證明N1和N2處理的AM群落組成較為相似，N1P1和N2P2群落結(jié)果較為接近，而對照與施肥處理之間的差異性較大。

圖1 不同施肥處理中AM真菌組成（科水平）Fig. 1 Relative average abundances of AM fungi under different fertilization (family level)

圖2 不同施肥處理中AM真菌組成（屬水平）Fig. 2 Relative average abundances of AM fungi under different fertilization (genus level)

表2 不同施肥土壤中AM真菌α多樣性Table 2 Effects of long-term fertilizer regimes on the OTUs, coverage, richness and diversity

圖3 不同施肥處理中AM真菌群落組成NMDS（OTU水平）Fig. 3 Results of NMDS analysis based on Bray-Crutis distance at OTU level

2.3 AM真菌群落組成與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性

RDA分析結(jié)果如圖 4，土壤理化性質(zhì)共解釋62.94% AM真菌群落組成變化。第一排序軸解釋群落變化的 24.20%，而第二排序軸解釋群落變化的19.49%。Monte Carlo檢驗顯示，有效磷（F= 3.9，P= 0.007，解釋量為19.6%），土壤pH（F= 3.3，P= 0.007，解釋量為20.2%）對AM真菌群落組成影響最顯著。

3 討論

3.1 氮肥對土壤AM真菌多樣性的影響

本研究結(jié)果表明，長期單施氮肥沒有顯著改變土壤中AM真菌豐富度和多樣性，這可能是AM真菌對施入土壤的氮肥反應(yīng)不敏感造成的[19,27]。然而，EGERTON-WARBURTON 等[16]通過蔗糖密度梯度離心分離 AM真菌孢子的研究方法發(fā)現(xiàn)（該方法靈敏度較低，僅能檢測到相對豐度較高物種種類），在磷缺乏的土壤中施用氮肥能夠提高土壤中 AM 真菌豐富度和多樣性，并且發(fā)現(xiàn)影響 AM 真菌多樣性的主要因素是相對豐度較低的物種。在本研究中，高通量測序能夠較全面檢測到土壤中物種種類，包括相對豐度較低的物種，更能準(zhǔn)確評價土壤中AM真菌多樣性[1]。長期施用氮肥改變了土壤 AM 真菌群落結(jié)構(gòu)。這可能是由于長期施肥降低了土壤中優(yōu)勢菌群的豐度，如與對照相比，Glomeraceae相對豐度在 N1處理中降低了 45.3%，在N2處理中降低了 79.5%；而提高了土壤中非優(yōu)勢菌群的相對豐度，如Paraglomeraceae等。因此，37年連續(xù)單施氮肥改變了土壤中AM真菌群落結(jié)構(gòu)，其通過降低優(yōu)勢菌群的豐度，提高非優(yōu)勢菌群豐度的方式影響AM真菌多樣性，使東北黑土AM真菌α多樣性保持穩(wěn)定。

圖4 不同施肥處理土壤中AM真菌和土壤理化性質(zhì)冗余分析（OTU水平）Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) between AM fungi and soil properties under different fertilization regimes (in OTU level)

表3 不同處理間AM真菌群落差異性分析Table 3 The AM fungal composition differentiation between different treatments under long-term fertilization

3.2 氮、磷混施對土壤AM真菌多樣性的影響

與 CAMENZIND等[26]研究結(jié)論一致，長期氮、磷肥混施降低土壤中 AM 真菌 α多樣性。同時還與EGERTON-WARBURTON 等[16]的研究結(jié)論一致，即在磷豐富土壤中，氮肥能夠降低土壤AM真菌多樣性?？紤]到AM真菌的主要功能是促進(jìn)植物對于土壤磷素的吸收[28]，土壤中磷肥的添加使AM真菌-植物共生體系利益分配發(fā)生變化，植物會減少對AM真菌物質(zhì)能量的分配[29]，經(jīng)過長期植物的選擇作用，某些得不到足夠能量的物種將被淘汰。然而，不同種類AM真菌的功能是相對保守的[30-31]，土壤中AM真菌多樣性降低說明土壤中AM真菌功能多樣性降低。

長期氮、磷添加改變土壤中AM真菌的群落組成。該結(jié)果和 QIN等[15]長期向土壤中添加營養(yǎng)元素將改變土壤中AM真菌群落組成的研究結(jié)論一致。當(dāng)植物缺乏某種元素時，植物會將其光合產(chǎn)物分配給能夠幫助植物獲得該元素的微生物[32]。在資源減少的情況下，能夠高效獲得光合產(chǎn)物的AM真菌將會增多，而獲得光合產(chǎn)物效率低的AM真菌將會減少[33]。在本研究中，長期施用磷肥提高了土壤中有效磷的含量。Glomeraceae在 N1P1和 N2P2處理中的相對豐度比 N1和N2高。這可能是因為Glomeraceae中許多種類（包括Glomus，F(xiàn)unneliformis）在磷缺乏的土壤中幫助植物吸收土壤中磷的作用較低[32]，而在磷含量較高土壤中，能提高作物對于磷的吸收[34]，并且只需要從寄主中獲取少量光合產(chǎn)物[34-35]。另外，F(xiàn)unneliformis中一些物種，如Funneliformis mosseae具有較強(qiáng)磷耐受性，并且傾向于在有效磷含量較高土壤中生存[36]。因此，長期氮、磷肥混施提高了該AM真菌類群的生長。與Glomeraceae相反，Gigasporaceae和Paraglomeraceae相對豐度在有磷肥添加土壤中低于無磷肥添加土壤，該研究結(jié)果與 LIN等[37]研究結(jié)果相同，說明在磷豐富的土壤中，植物會減少對該AM類群的能量投入，而在磷缺乏的土壤中，植物可能加大對Gigasporaceae和Paraglomeraceae的能量供應(yīng)，從而獲得更多的磷元素[31]。如Gigaspora、Paraglomu在磷缺乏土壤中可以提高植物對于磷素吸收，但是當(dāng)土壤中有效磷含量提高時，植物不再需要其提供磷，尤其像小麥這種須根植物[38-39]。

由于不同種類AM真菌的功能相對保守[31]，AM真菌群落結(jié)構(gòu)的改變不僅改變植物-AM 真菌物質(zhì)能量交換的效率，也將影響土壤中其他生物過程。例如，Glomeraceae對于病原菌的抗性高于Gigasporaceae[40]。在本研究中，長期施肥降低了Glomeraceae的豐度，說明長期施用化肥提高植物發(fā)生病害的可能性；與氮、磷肥混施相比，長期單施氮肥降低了Glomeraceae豐度，而提高了Gigasporaceae豐度，說明長期單施氮肥使植物發(fā)生病害的可能性高于氮、磷肥混施。

3.3 AM真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化相關(guān)性

在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，影響AM真菌群落組成和分布的主要因素是土壤 pH[41]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AM真菌群落組成與土壤pH具有較強(qiáng)的相關(guān)性（F=3.3，P= 0.007），這可能是因為土壤pH能夠直接影響AM真菌生理狀態(tài)、改變其生態(tài)位，并通過調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分的生物有效性等間接影響AM真菌群落[42]。另外，不同種類的AM真菌對土壤酸堿性的耐受不同，如Glomeraceae對酸性土壤比較敏感，長期施用氮、磷肥降低Glomeraceae的相對豐度[43]。RDA分析表明，東北黑土AM真菌除了受土壤pH的影響外，也受土壤有效磷含量的影響。研究已表明，土壤中AM真菌對土壤中磷的活化作用受土壤中有效磷的影響[7]，因此，該研究結(jié)果能夠指導(dǎo)我們合理施肥以及利用AM真菌提高作物產(chǎn)量。如Gigasporaceae和Paraglomeraceae可能在磷缺乏的土壤中對植物吸收土壤中磷發(fā)揮更大的作用[31]。。

4 結(jié)論

長期單施氮肥對AM真菌多樣性影響不大，氮、磷肥混施降低東北黑土AM真菌多樣性；土壤pH和有效磷含量是導(dǎo)致土壤中AM真菌群落差異的主要因素。因此，長期施用氮、磷肥引起土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，降低氮磷利用率，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分流失，造成環(huán)境污染，有悖于節(jié)能減排目標(biāo)；改變了黑土中AM真菌群落結(jié)構(gòu)組成，使土壤中原有的氮磷循環(huán)發(fā)生改變。本研究結(jié)果為認(rèn)識AM真菌在長期施肥土壤中的群落組成變化提供重要的參考，并為將來利用AM真菌提高土壤養(yǎng)分有效性提供依據(jù)。