王曉煥，潘彤彤，練森，王彩霞，李保華

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109）

0 引言

【研究意義】蘋果樹腐爛病是由蘋果黑腐皮殼（Valsa mali）引起的枝干病害[1-2]，主要造成死枝、死樹，甚至毀園，嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1,3]。腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的存活與生長(zhǎng)擴(kuò)展，是導(dǎo)致舊病斑復(fù)發(fā)和剪鋸口發(fā)病的重要原因[4-5]。揭示蘋果樹腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展機(jī)制、影響因素和周年擴(kuò)展動(dòng)態(tài)，可深入了解蘋果腐爛病的發(fā)生流行規(guī)律，為病害的流行預(yù)測(cè)和防控提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自1916年遼寧省南部發(fā)現(xiàn)蘋果腐爛病[6]，至今已有4次大的流行[7]，每次流行都造成大批蘋果樹死亡，大批果園毀壞，給蘋果生產(chǎn)造成重大損失[1]。腐爛病是蘋果樹的重要病害，在中國(guó)各蘋果產(chǎn)區(qū)果園內(nèi)都有分布，而且還有嚴(yán)重危害的趨勢(shì)。據(jù)2008年調(diào)查，蘋果主產(chǎn)區(qū)腐爛病的總體病株率為 52.7%，部分地區(qū)發(fā)病率高達(dá)85%以上[8]。自20世紀(jì)初，日本和中國(guó)對(duì)蘋果樹腐爛病菌的病原學(xué)、發(fā)生流行規(guī)律、 防治技術(shù)等方面開展了大量研究，提出了多種防控措施[8-16]。近年來，又從分子和生理生化層面對(duì)病菌的致病機(jī)制[17-22]開展了大量研究，但腐爛病仍未得到有效控制。剪鋸口是腐爛病菌的重要侵染孔口[2]，舊病斑復(fù)發(fā)是造成腐爛病連年發(fā)病的重要原因[4,14]。2011年春季對(duì)煙臺(tái)蘋果產(chǎn)區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，80%的新發(fā)病斑來自剪鋸口的侵染，60%新發(fā)病斑為舊病斑復(fù)發(fā)后的病斑[2]。組織學(xué)研究結(jié)果已證明，腐爛病菌能從剪鋸口侵染蘋果枝干木質(zhì)部，在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展，并長(zhǎng)期潛伏[5]，在枝干木質(zhì)部?jī)?nèi)潛伏的腐爛病菌，在適宜條件下生長(zhǎng)擴(kuò)展到達(dá)皮層的活體細(xì)胞后，產(chǎn)生毒素和木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶等細(xì)胞壁降解酶，殺死皮層組織，引發(fā)腐爛病[2,23-29]。腐爛病菌在蘋果枝干木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展，也是導(dǎo)致舊病斑復(fù)發(fā)的重要原因[4,16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展是影響腐爛病發(fā)生與流行的重要環(huán)節(jié)。木質(zhì)部?jī)?nèi)的腐爛病菌生長(zhǎng)速度快，擴(kuò)展距離長(zhǎng)，到達(dá)皮層的數(shù)量多，復(fù)發(fā)病斑數(shù)量多，剪鋸口發(fā)病重；相反，木質(zhì)部腐爛病菌的生長(zhǎng)速度慢，腐爛病發(fā)病就輕[2]。目前，對(duì)于腐爛病菌在木質(zhì)部的生長(zhǎng)擴(kuò)展及其影響因素了解很少。為了更深入地了解腐爛病的發(fā)生與流行機(jī)制，本研究采用菌餅接種剪鋸口的方法，測(cè)試溫度、枝條齡期、枝條含水量等對(duì)腐爛病菌在木質(zhì)部生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過接種后觀測(cè)病菌在木質(zhì)部的生長(zhǎng)擴(kuò)展情況，明確腐爛病菌在木質(zhì)部的生長(zhǎng)擴(kuò)展機(jī)制及影響因素，深入了解蘋果腐爛病的發(fā)生流行規(guī)律，為病害的有效防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腐爛病菌來源及處理

2010年自山東萊陽(yáng)一個(gè)蘋果園內(nèi)采集腐爛病枝，經(jīng)75%的酒精消毒后，切取病健交界處的皮層組織，轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中，用直徑0.8 mm的毛細(xì)管自菌落邊緣挑取單菌絲，純化病菌。分離菌株在-18℃的冰箱內(nèi)保存。試驗(yàn)前，將腐爛病菌在PDA培養(yǎng)基中活化，在25℃繼代培養(yǎng)3 d，用直徑為0.5 cm的打孔器打取菌落外緣的菌餅，備用。

1.2 木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌擴(kuò)展距離的檢測(cè)

腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離采用活體皮層檢測(cè)法。8—9月份蘋果樹生長(zhǎng)旺盛期，剪取直徑 0.8—1.5 cm健康的蘋果枝條，保存于1—5℃的冷藏箱內(nèi)。使用前，將枝條剪成2 cm長(zhǎng)的莖段，從莖段一側(cè)割口后，剝?nèi)⊥暾钠?，作為檢測(cè)皮層。

將待檢測(cè)枝段剝除皮層，露出木質(zhì)部，從接種端開始，順序剪下7個(gè)莖段，每段長(zhǎng)度1 cm，并順序標(biāo)號(hào)。將剪取莖段在75%的酒精中浸泡30 s，待表面的酒精揮發(fā)后，檢測(cè)枝干木質(zhì)部?jī)?nèi)是否潛帶有腐爛病菌（具體檢測(cè)方法請(qǐng)查閱國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)網(wǎng)，專利申請(qǐng)?zhí)?015106262642）。

1.3 溫度對(duì)腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響

測(cè)試8個(gè)溫度（0、5、10、15、20、25、30和35℃）對(duì)腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)的影響，每個(gè)溫度接種 5根枝條。溫度由 8臺(tái)恒溫箱控制（MGC-250BP-2，上海一恒）。2015年蘋果樹落葉后，自3—5年生的富士果樹上，剪取基部直徑0.8—1.2 cm當(dāng)年生的長(zhǎng)枝條，截除梢部的20 cm，將余下枝段截成15 cm長(zhǎng)的枝段，隨機(jī)選取5根作為一組，平放于8個(gè)保濕缸內(nèi)。每個(gè)保濕缸中加入300 mL蒸餾水，用于保持 100%的相對(duì)濕度。保濕缸密封后，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的恒溫箱中預(yù)處理12 h。接種時(shí)，從保濕缸中取出枝段，將菌餅放置在枝段的頂端，菌絲面緊貼剪口，用保鮮膜包扎后，再放回到保濕缸內(nèi)，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的恒溫箱中保濕培養(yǎng)。72 h后取出接種枝段，測(cè)量腐爛病斑長(zhǎng)度，檢測(cè)腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離。

1.4 枝條相對(duì)含水量對(duì)腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響

蘋果樹落葉后，自3—5年生的富士果樹上剪取當(dāng)年生蘋果枝條，截除梢部的20 cm，將余下枝段截成15 cm長(zhǎng)的枝段。選取30個(gè)粗度一致的枝條，完全浸泡于蒸餾水中，使其充分吸水，24 h后全部取出，晾干表面的水分，用天平（1/1 000 g）稱取每個(gè)枝段的質(zhì)量，并記錄。將浸水枝段分成6組，每組5根，分別在室內(nèi)自然條件下放置0、3、6、12、24和48 h，使枝條自然失水，然后再逐一稱重，計(jì)算每個(gè)枝段的相對(duì)含水量。相對(duì)含水量=100%×[1-(失水前的質(zhì)量-失水后的質(zhì)量)/失水前的質(zhì)量]。稱重后，將所有枝條，在50℃融化的石蠟中浸蘸1 min，將枝段包被蠟衣，防止水分散失。接種時(shí)，用消毒果枝剪剪除頂端 0.5 cm，再接種腐爛病菌。接種枝條在 25℃下保濕培養(yǎng)72 h后，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，檢測(cè)病菌在枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離。同時(shí)，接種未浸泡處理新鮮枝條和浸泡處理未經(jīng)晾干處理的枝條各5根，25℃下保濕培養(yǎng)7 d，測(cè)量木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌擴(kuò)展距離。

1.5 枝條齡期對(duì)枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)腐爛病菌生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響

蘋果樹落葉后，自5年生的富士蘋果樹上隨機(jī)剪取當(dāng)年生、1年生、2—3年生的蘋果枝條。當(dāng)年生和1年生枝條基部直徑約1 cm，2—3年生枝條直徑約2 cm。當(dāng)年生枝條截除梢部的20 cm，將所有枝條截成15 cm長(zhǎng)的枝段，每個(gè)齡期10段。枝段頂端接種腐爛病菌，在25℃下保濕培養(yǎng)72 h后，檢測(cè)病菌在木質(zhì)部的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離。

1.6 腐爛病菌在活體、離體和高溫處理枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展

3—4月份蘋果頂芽開始膨大后，選擇3—5年生的富士蘋果樹 5株，每株樹上隨機(jī)選取基部直徑 0.8—1.0 cm的1年生枝條3枝，在離基部15 cm處剪斷枝條，在剪口處立即接種腐爛病菌，接種后用保鮮膜包扎。同時(shí)，從所剪除枝條的基部再剪取15 cm的枝段，接種腐爛病菌，同一株樹上的3個(gè)枝條一組，插入口徑5.5 cm組培瓶中，放置相應(yīng)的樹下，加入60 mL蒸餾水水培。培養(yǎng)期間溫度在10—20℃。7 d后測(cè)量病斑長(zhǎng)度，檢測(cè)病菌在木質(zhì)部的擴(kuò)展距離。11—12月蘋果落葉后，將盆栽蘋果樹移入玻璃溫室內(nèi)，重復(fù)同樣試驗(yàn)。

為了驗(yàn)證蘋果枝條對(duì)腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展是否存在抗性，12月蘋果樹休眠期，從一年生蘋果枝條上剪取15 cm的枝段20個(gè)，隨機(jī)分為兩組，其中一組在121℃下高溫處理20 min后接種，另一組直接接種腐爛病菌。接種后25℃下保濕培養(yǎng)7 d，檢測(cè)木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌擴(kuò)展距離。

1.7 腐爛病菌在蘋果枝干不同組織配制培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展

為了解腐爛病菌在木質(zhì)部生長(zhǎng)擴(kuò)展所需要的營(yíng)養(yǎng)成分，7—9月份剪取一年生的蘋果枝條，將木質(zhì)部與韌皮部剝離，置于65℃的烘箱內(nèi)烘干24 h。將烘干的木質(zhì)部和韌皮部用高速萬能粉碎機(jī)粉碎成粉末狀。稱取10 g韌皮部粉末，2 g瓊脂粉，加入100 mL蒸餾水，制成固體韌皮部培養(yǎng)基（EPH），不加瓊脂粉制成液體EPH，121℃滅菌20 min。稱取10 g木質(zhì)部粉末，按同樣方法制成固體、液體木質(zhì)部培養(yǎng)基（EXY）。

稱取10 g韌皮部粉末，加水煮沸20 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液和殘?jiān)蛛x后，分別定容至100 mL，再加入2 g瓊脂粉，分別制成韌皮部上清液培養(yǎng)基（SPH）和韌皮部殘?jiān)囵B(yǎng)基（RPH）；不加瓊脂粉制成液體培養(yǎng)基SPH和RPH，121℃滅菌20 min。稱取10 g木質(zhì)部粉末，按同樣的方法制成固體、液體木質(zhì)部上清液培養(yǎng)基（SXY）和固體、液體木質(zhì)部殘?jiān)囵B(yǎng)基（RXY）。

稱取10 g木質(zhì)部粉末，放入燒杯中，加入5%的濃硫酸50 mL，在100℃水中水浴20 min，靜置1 min后，濾除硫酸溶液，殘?jiān)尤?0 mL蒸餾水，100℃水浴20 min，濾除水；用同樣方法將殘?jiān)磸?fù)沖洗直至pH為7.0，定容至100 mL，加入2 g瓊脂，121℃滅菌20 min，制成酸處理木質(zhì)部殘?jiān)囵B(yǎng)基（AXY）。稱取10 g木質(zhì)部材料，放入燒杯中，加5%的氫氧化鈉50 mL，按同樣的方法，制成堿處理木質(zhì)部殘查培養(yǎng)基（BXY）。

將每種固體培養(yǎng)基倒3個(gè)平板，在平板中央接一個(gè)腐爛病菌的菌餅，25℃下培養(yǎng)72 h后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。以標(biāo)準(zhǔn)的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和2%瓊脂培養(yǎng)基（WAG）為對(duì)照，比較腐爛病菌在不同組分培養(yǎng)基上的菌落直徑。

1.8 腐爛病菌在富士枝條上生長(zhǎng)擴(kuò)展的周年動(dòng)態(tài)

自2015年10月15日開始，每半月1次，于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地選取3—5年生的富士蘋果樹，在每株樹上隨機(jī)選取基部直徑0.8—1.0 cm的枝條1—2枝，每次共接種5個(gè)枝條，在離基部15 cm處剪斷枝條，在剪口處立即接種腐爛病菌的菌餅，使菌絲緊貼剪口，接種后用保鮮膜包扎，室外自然條件培養(yǎng)。同時(shí)，從剪除枝條的基部再剪取15 cm的枝段，接種腐爛病菌，5個(gè)枝段為一組，插入口徑5.5 cm組培瓶中，加入60 mL蒸餾水，轉(zhuǎn)入25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。接種7 d后，測(cè)量病斑長(zhǎng)度，剝?nèi)テ訙y(cè)量木質(zhì)部?jī)?nèi)變色組織長(zhǎng)度，檢測(cè)腐爛病菌在木質(zhì)部的擴(kuò)展距離。全部試驗(yàn)至2017年8月30日結(jié)束，共接種45批次，225個(gè)活體枝條和相對(duì)應(yīng)的225個(gè)離體枝條。

1.9 數(shù)據(jù)分析

以每個(gè)木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌擴(kuò)展距離、病斑長(zhǎng)度和菌落直徑的觀測(cè)值為基本數(shù)據(jù)單元，用ANOVA分析溫度、枝條相對(duì)含水量、不同枝條組織和枝條齡期對(duì)腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)和皮層內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響，比較病菌在木質(zhì)部和皮層生長(zhǎng)擴(kuò)展的差異。用T測(cè)驗(yàn)比較腐爛病菌在離體枝條與活體枝條，高溫處理枝條和未經(jīng)高溫處理枝條內(nèi)的擴(kuò)展距離。ANOVA用廣義線模型（GLM）實(shí)現(xiàn)，在GLM模型中所有觀測(cè)值假設(shè)為正態(tài)分布，調(diào)用Gaussian函數(shù)。不同處理間的差異顯著性用Tukey多重比較（用glht完成）廣義線性模型的預(yù)測(cè)值實(shí)現(xiàn)。

用溫度模型f(t)=A·[(M-t)/(M-O)]·{(t/O)^[O/(M-O)]}擬合溫度與病斑長(zhǎng)度及腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離的關(guān)系。其中，t為溫度（℃），f(t)為病斑長(zhǎng)度或木質(zhì)部?jī)?nèi)菌絲的擴(kuò)展距離，M、O和A為擬合參數(shù)，M為病菌生長(zhǎng)擴(kuò)展溫度上限（℃），O為最適生長(zhǎng)溫度（℃），A為最大病斑長(zhǎng)度或木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌最大擴(kuò)展距離（cm）。

用指數(shù)模型f(w)=A·exp{-B[(100-w)/100]}擬合枝條相對(duì)含水量與腐爛病斑長(zhǎng)度的關(guān)系。其中，w為枝條相對(duì)含水量（%），f(w)為病斑長(zhǎng)度（cm），B和A為擬合參數(shù)，B為指數(shù)增長(zhǎng)速率，A為最大病斑長(zhǎng)度（cm）。用直線模型擬合枝條失水時(shí)間與相對(duì)含水量之間的關(guān)系。

所有數(shù)據(jù)分析用R語(yǔ)言完成，在Var. 3.4.0實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)腐爛病菌在枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響

接種腐爛病菌的枝條，在 5—35℃的范圍內(nèi)培養(yǎng)72 h后，木質(zhì)部?jī)?nèi)都能檢測(cè)到病菌。在0℃下培養(yǎng)的枝條，距接種點(diǎn) 1 cm的木質(zhì)部?jī)?nèi)沒有檢測(cè)到腐爛病菌。在8個(gè)測(cè)試溫度120個(gè)接種枝段中，腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的平均擴(kuò)展距離為0.66 cm，最大為3 cm，腐爛病斑平均長(zhǎng)度為0.45 cm，最長(zhǎng)為2.5 cm。腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離顯著長(zhǎng)于在皮層形成病斑的長(zhǎng)度（P＜0.01）。

接種到富士蘋果離體枝條剪口上的腐爛病菌在30℃擴(kuò)展最快，培養(yǎng)72 h后，病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離為1.4 cm，病斑長(zhǎng)度為0.95 cm，其次是25℃和35℃。0℃下病菌擴(kuò)展最慢，病斑長(zhǎng)度只有0.23 cm，木質(zhì)部?jī)?nèi)菌絲擴(kuò)展距離沒有達(dá)到1 cm（圖1）。腐爛病菌在蘋果離體枝條上形成的病斑長(zhǎng)度和在木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)距離隨溫度的變化可用溫度模型描述（表 1、圖1）。模型可描述病斑長(zhǎng)度總變異度的 99.10%，木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌擴(kuò)展距離的99.92%。依據(jù)模型，腐爛病斑擴(kuò)展的最適溫度為29.6℃，最高38.6℃，培養(yǎng)72 h病斑最大長(zhǎng)度為0.86 cm；木質(zhì)部?jī)?nèi)腐爛病菌最適擴(kuò)展溫度為30.1℃，最高為42.2℃，病菌的最大擴(kuò)展距離為1.29 cm（表1、圖1）。

表1 擬合腐爛病菌在離體枝條上生長(zhǎng)擴(kuò)展溫度模型的參數(shù)估測(cè)值Table 1 Parameter estimates of the temperature model fitted the growth and extension of V. mali in the detached branches

2.2 枝條相對(duì)含水量對(duì)腐爛病菌在枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響

蘋果枝條在蒸餾水中浸泡24 h后，再接種腐爛病菌，在25℃下培養(yǎng)7 d后，病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)擴(kuò)展距離平均為3.20 cm，顯著（P＜0.05）短于在未浸水枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離4.03 cm（圖2）。

經(jīng)蒸餾水浸泡的枝條，隨在室內(nèi)失水時(shí)間的延長(zhǎng)，枝條相對(duì)含水量呈直線下降。48 h后，枝條相對(duì)含水量降至 86.38%。失水時(shí)間與枝條相對(duì)含水量的關(guān)系可用直線模型Y=99.32-0.2806X描述（圖3-A），

圖1 接種到富士蘋果離體枝條上的腐爛病菌在不同溫度下培養(yǎng)72 h后形成的病斑長(zhǎng)度（A）和在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離（B）Fig. 1 The length of lesions (A) and the extension distances in the xylem (B) of V. mali when inoculated to the detached Fuji apple branches and cultured at different temperatures for 72 hours

圖2 腐爛病菌在浸水和未浸水枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)25℃下培養(yǎng)7 d的擴(kuò)展距離Fig. 2 The extension distances of V. mali in the xylem when the pathogen inoculated to the soaked and un-soaked apple branches in distill water and cultured at 25℃ for 7 days

其中X為失水時(shí)間（h），Y為相對(duì)含水量（%）。

當(dāng)枝條相對(duì)含水量大于90%時(shí)，枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的病菌生長(zhǎng)擴(kuò)展速度快，平均每天達(dá)1 cm以上，枝條相對(duì)含水量對(duì)木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌生長(zhǎng)擴(kuò)展無顯著影響（P＞0.05）。當(dāng)枝條的相對(duì)含水量降至 90%以下時(shí)，病菌的擴(kuò)展速度明顯減緩，病菌擴(kuò)展速度顯著慢于枝條含水量大于90%時(shí)的病菌擴(kuò)展速度（P＜0.05）（圖3-B）。

隨枝條相對(duì)含水量的降低，病菌在皮層內(nèi)擴(kuò)展速度減緩，所形成腐爛病斑長(zhǎng)度變小。枝條的相對(duì)含水量對(duì)腐爛病菌在皮層內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展形成的病斑長(zhǎng)度的影響可用指數(shù)模型Y=1.46exp（-12.47（100-X）/100）描述（圖3-C）。其中，X為枝條相對(duì)含水量（%），Y為病斑長(zhǎng)度（cm），模型可以描述 90個(gè)觀測(cè)值總變異度的24.44%。依據(jù)該模型，病斑的最大擴(kuò)展長(zhǎng)度為A=1.46 cm（圖3-C）。

2.3 枝條齡期對(duì)腐爛病菌在枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響

接種到當(dāng)年生、1年生和2—3年生枝條木質(zhì)部的腐爛病菌，25℃下恒溫培養(yǎng)72 h后，木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌的擴(kuò)展距離分別為3.10、2.57和2.40 cm，病菌在2—3年生枝條木質(zhì)部的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度顯著慢于在當(dāng)年生枝條木質(zhì)部的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度（P＜0.05）（圖4）。

圖3 浸水24 h的蘋果枝條失水不同時(shí)間后的相對(duì)含水量（A）及接種到枝條上的腐爛病菌經(jīng)25℃下培養(yǎng)72 h后在木質(zhì)部?jī)?nèi)和皮層內(nèi)的擴(kuò)展距離（B、C）Fig. 3 The relative water content of apple branches when the branches placed indoor for different times after soaking in distill water for 24 hours (A), and the extension distances of V. mali in the xylem and cortex (B, C)

圖 4 接種到不同齡期枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)腐爛病菌在 25℃下培養(yǎng)72 h的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離Fig. 4 The extension distances of V. mali in the xylem when inoculated to branches of different ages and cultured at 25℃ for 72 hours

2.4 腐爛病菌在離體、活體及高溫處理枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度

3—4月份蘋果萌芽期，接種到蘋果離體枝條剪口上的腐爛病菌，自然條件下（10—20℃）培養(yǎng)7 d后，在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離平均為2.00 cm，顯著長(zhǎng)于在活體枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)病菌的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離1.04 cm（P＜0.01）。離體枝條上所形成腐爛病斑的平均長(zhǎng)度為0.82 cm，也顯著長(zhǎng)于在活體枝條上所致病斑長(zhǎng)度0.18 cm（P＜0.01）（圖5-A）。11—12月份蘋果休眠期，接種到蘋果離體枝條剪口上的腐爛病菌，在溫室內(nèi)（10—20℃）培養(yǎng)7 d后，在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離平均為1.04 cm，顯著短于在活體枝條上的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離2.20 cm（P＜0.01）（圖5-B）。12月份，剪取蘋果枝條在121℃下處理20 min，接種腐爛病菌。腐爛病菌在高溫處理枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離平均為4.37 cm，顯著長(zhǎng)于未經(jīng)高溫處理枝條內(nèi)腐爛病菌的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離2.87 cm（P＜0.01）（圖5-C）。

2.5 腐爛病菌在蘋果枝條不同組織所配制培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展

腐爛病菌在蘋果枝條不同部位配制的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，所形成菌落直徑都顯著大于在水瓊脂中的菌落直徑（1.79 cm）（P＜0.05）。腐爛病菌在木質(zhì)部（EXY）和韌皮部（EPH）培養(yǎng)基中的菌落直徑分別為5.60和5.15 cm，兩者無顯著差異（P＞0.05），但顯著大于在PDA中的菌落直徑4.12 cm（P＜0.05）。在韌皮部上清液（SPH）、韌皮部殘?jiān)≧PH）、木質(zhì)部上清液（SXY）和木質(zhì)部殘?jiān)≧XY）中，腐爛病菌的菌落直徑與在 PDA中的菌落直徑無顯著差異（P＞0.05）（圖6）。然而，在韌皮部培養(yǎng)基上，腐爛病菌菌落的菌絲濃密，氣生菌絲多，呈絨毛狀；在木質(zhì)部培養(yǎng)基中，腐爛病菌落的菌絲稀疏，氣生菌絲很少，而基質(zhì)內(nèi)的擴(kuò)展菌絲多（圖 7）。在強(qiáng)酸處理木質(zhì)部殘?jiān)囵B(yǎng)基中（AXY），腐爛病菌的菌落直徑為3.64 cm，與在未經(jīng)處理木質(zhì)部殘?jiān)囵B(yǎng)基中的菌落直徑（4.29 cm）無顯著差異（P＞0.05），而在強(qiáng)堿處理木質(zhì)部殘?jiān)囵B(yǎng)基中的菌落直徑為2.10 cm，顯著小于未經(jīng)處理木質(zhì)部殘?jiān)囵B(yǎng)基中的菌落直徑（P＜0.05）（圖6）。

圖5 腐爛病菌在活體、離體和高溫處理枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)培養(yǎng)7 d后的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離Fig. 5 The extension distances of V. mali in the xylem of the in vivo, in vitro and high temperature treated apple branches after 7 days incubation

圖 6 腐爛病菌在蘋果枝條不同組織所配制培養(yǎng)基中 25℃培養(yǎng)3 d后的菌落直徑Fig. 6 Colony diameter of V. mali cultured in medium made of different parts of apple branch tissues at 25℃ for 3 days

2.6 腐爛病菌在蘋果枝條上生長(zhǎng)擴(kuò)展的周年動(dòng)態(tài)

自2015年10月15日至2017年8月31日共接種45批枝條，共450個(gè)活體枝條和離體枝條，其中4個(gè)活體枝條在試驗(yàn)中丟失。在221個(gè)活體枝條上，腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展距離為 1.75 cm，最長(zhǎng)為5.0 cm；在韌皮部形成病斑的長(zhǎng)度為0.88 cm（圖8），最大長(zhǎng)度為2.9 cm，出現(xiàn)在2016年的9月16日，最小病斑長(zhǎng)度為0，出現(xiàn)在12月至次年3月的12次接種（圖9）；病菌導(dǎo)致木質(zhì)部組織變色長(zhǎng)度為0.93 cm。腐爛病菌在木質(zhì)部的擴(kuò)展距離顯著長(zhǎng)于（P＜0.01）在韌皮部擴(kuò)展所形成的病斑長(zhǎng)度，及在木質(zhì)部?jī)?nèi)造成組織變色的長(zhǎng)度。在225個(gè)離體枝條上，腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的擴(kuò)展距離為2.48 cm（圖8），最長(zhǎng)5.0 cm，最短1.0 cm（圖9）；在韌皮部造成的病斑長(zhǎng)度為1.98 cm，最長(zhǎng)4.6 cm，最短0.6 cm，在木質(zhì)部造成組織變色的長(zhǎng)度為1.99 cm。病菌在木質(zhì)部的擴(kuò)展距離也顯著長(zhǎng)于（P＜0.01）在韌皮部造成病斑的長(zhǎng)度，及在木質(zhì)部造成組織變色的長(zhǎng)度（圖8）。

不同時(shí)期腐爛病菌在蘋果活體枝條上的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度變化較大。自12月至次年3月中旬，腐爛病菌在活體枝條上的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度慢，在木質(zhì)部的擴(kuò)展距離最短，不超過1 cm，在韌皮部所造成病斑的長(zhǎng)度最小，長(zhǎng)度都不超過0.5 cm。進(jìn)入5月份以后，病菌的擴(kuò)展速度明顯加快，接種1周后，在木質(zhì)的擴(kuò)展距離都在2.0 cm以上，其中8、9月份距離最長(zhǎng)，都超過4.0 cm；在韌皮部形成病斑的長(zhǎng)度都在1 cm以上，其中7、8月份高溫季節(jié)所形成病斑的長(zhǎng)度最大，多在2.0 cm以上。進(jìn)入11月份，病菌枝條上的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度明顯減緩（圖9）。

圖7 腐爛病菌在韌皮部殘?jiān)≧PH）和木質(zhì)部殘?jiān)≧XY）培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3 d的菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of V. mali in the medium of RPH and RXY cultured at 25℃ for 3 days

圖8 腐爛病菌在蘋果活體枝條（自然溫度下培養(yǎng)）和離體枝條（25℃下培養(yǎng)）木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展距離、所致木質(zhì)部組織變色的長(zhǎng)度及所造成病斑長(zhǎng)度Fig. 8 The extension distance of V. mali in the xylem, the length of changed color xylem and the length of canker lesion on the attached branches (cultured at natural temperature) and the detached branches(cultured at 25℃)

3 討論

腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展距離顯著長(zhǎng)于在皮層內(nèi)擴(kuò)展形成腐爛病斑的長(zhǎng)度，以及木質(zhì)部組織變色的長(zhǎng)度。木質(zhì)部組織變色的長(zhǎng)度與病斑的長(zhǎng)度基本一致。在木質(zhì)部中能切片顯微觀測(cè)到腐爛病菌的部位，并未發(fā)現(xiàn)到木質(zhì)部變色現(xiàn)象[5]。由此推測(cè)，木質(zhì)部變色可能是腐爛病菌在皮層擴(kuò)展致病所產(chǎn)生的有害物質(zhì)、毒素、色素等所致，而不是由腐爛病菌在木質(zhì)部生長(zhǎng)擴(kuò)展所致。實(shí)際生產(chǎn)中，在刮治腐爛病斑時(shí)，以刮凈木質(zhì)部的變色組織為標(biāo)準(zhǔn)。然而，依據(jù)本研究的結(jié)果，刮凈木質(zhì)部的變色組織，并沒有徹底刮除木質(zhì)部?jī)?nèi)的腐爛病菌。

在 5—35℃下，腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)都能生長(zhǎng)擴(kuò)展，最適為30℃，最高42℃，倫瑩瑩等研究表明腐爛病菌菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25—30℃，最高為40℃[30]，與本研究結(jié)果基本一致。自然條件下，接種到剪口上的腐爛病菌，在接種初期的生長(zhǎng)擴(kuò)展主要受溫度的影響，而受寄主抗病性的影響較小，病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展速度，與病斑發(fā)展速度基本一致。12月至次年3月，病菌在枝條上的生長(zhǎng)速度很慢，培養(yǎng)7 d后在皮層所形成病斑的長(zhǎng)度幾乎為0，在木質(zhì)部的擴(kuò)展距離也不足1 cm。6—9月，腐爛病菌在枝條上的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d所形成的病斑長(zhǎng)度都超過1 cm，在木質(zhì)部?jī)?nèi)擴(kuò)展距離都超過2.5 cm。晚秋、冬季或早春侵入皮層的腐爛病菌，受溫度的影響，病斑擴(kuò)展很慢，所形成的病斑很小，外觀難以察覺[31]。進(jìn)入2、3月份，遇溫暖天氣或樹體局部高溫，小病斑可迅速擴(kuò)展形成大型病斑，形成春季發(fā)病高峰。春季發(fā)病高峰的出現(xiàn)應(yīng)是秋、冬、春季病菌積累生長(zhǎng)的結(jié)果。

枝條的相對(duì)含水量對(duì)腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展具有顯著影響。當(dāng)枝條相對(duì)含水量在90%以上時(shí)，不同處理間差異不顯著，生長(zhǎng)擴(kuò)展均比較快，但當(dāng)枝條的相對(duì)含水量低于90%時(shí)，病菌的生長(zhǎng)速度明顯減緩。陳策等研究發(fā)現(xiàn)樹皮的充水度對(duì)枝條愈傷能力、抗擴(kuò)展能力有顯著的影響[32]，枝條充水度低，抗病性差，病斑擴(kuò)展速度快。本研究則僅測(cè)試了枝條含水量對(duì)病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的影響。腐爛病菌主要從剪鋸口和表層的腐爛病斑進(jìn)入木質(zhì)部。蘋果修剪后，剪鋸口常裸露，刮除腐爛病斑后，木質(zhì)部也裸露，從而導(dǎo)致木質(zhì)部失水，相對(duì)含水量降低，進(jìn)而抑制腐爛病菌在木質(zhì)部生長(zhǎng)擴(kuò)展。然而，持續(xù)的陰雨會(huì)浸透木質(zhì)部，可能會(huì)導(dǎo)致腐爛病菌在木質(zhì)部快速生長(zhǎng)。前一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)的降雨量和降雨持續(xù)時(shí)間是否能提高腐爛病舊病斑復(fù)發(fā)率和剪鋸口發(fā)病率，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖9 腐爛病菌在離體枝條（25℃下培養(yǎng)）和活體枝條（自然溫度下培養(yǎng)）木質(zhì)部和皮層內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展動(dòng)態(tài)Fig. 9 The growth dynamics of V. mali in the xylem and cortex of detached branches (cultured at 25℃) and attached branches(cultured at natural temperatures)

腐爛病菌能夠在木質(zhì)部的浸出液中生長(zhǎng)擴(kuò)展，而且所形成的菌落直徑與在 PDA上形成的菌落直徑無顯著差異。由此推斷，腐爛病菌能夠或主要利用木質(zhì)部?jī)?nèi)的可溶性養(yǎng)分在木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展，木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)可溶性養(yǎng)分的濃度可能是影響腐爛病菌在蘋果枝干木質(zhì)部?jī)?nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展的重要因素。蘋果枝條浸水后，腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)速度明顯減緩，可能與木質(zhì)部?jī)?nèi)可溶性養(yǎng)分的濃度降低有關(guān)，或因?qū)Ч艹渌?，阻礙病菌擴(kuò)展造成的。PéREZ-DONOSO等報(bào)道了內(nèi)生細(xì)菌Xylella fastidiosa產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶能夠使葡萄藤管間紋孔膜的孔徑變大，從而使內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)的蔓延更加便利，有利于在植物體內(nèi)定殖[33]。腐爛病菌在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展，但沒有發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管結(jié)構(gòu)被破壞的現(xiàn)象[5]。在病斑的刮治過程中，也沒有發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)病斑內(nèi)的木質(zhì)部受到腐爛病菌的破壞。對(duì)于腐爛病菌能否產(chǎn)生各種酶類分解或改變木質(zhì)部結(jié)構(gòu)組分，還有待于深入研究。

在多年生枝條上，病菌的擴(kuò)展速度慢，在當(dāng)年生的枝條上擴(kuò)展速度快，這可能與枝條木質(zhì)部的結(jié)構(gòu)有關(guān)。多年生枝條木質(zhì)部的結(jié)構(gòu)比較致密，當(dāng)年生枝條的結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，致密的結(jié)構(gòu)抑制了病菌快速擴(kuò)展。腐爛病菌在高溫處理枝條內(nèi)生長(zhǎng)擴(kuò)展速度快，在未經(jīng)高溫處理枝條上生長(zhǎng)擴(kuò)展速度慢，在離體和活體枝條上的擴(kuò)展速度也不同。對(duì)于導(dǎo)致這一現(xiàn)象的確切原因還不清楚。一種解釋是高溫破壞了木質(zhì)部的結(jié)構(gòu)，消除了病菌擴(kuò)展過程中所遇到的障礙，從而加快了病菌的擴(kuò)展速度；另一種解釋是高溫處理破壞木質(zhì)部的結(jié)構(gòu)或某些組分，增加了木質(zhì)部?jī)?nèi)可溶性養(yǎng)分的濃度，促進(jìn)了腐爛病菌的生長(zhǎng)；第三種可能的解釋為，蘋果枝條存在由活體組織產(chǎn)生的抗性，經(jīng)高溫處理或剪離母體后，會(huì)失去抗性或抗性降低。

4 結(jié)論

腐爛病菌在蘋果枝條木質(zhì)部?jī)?nèi)主要利用可溶性養(yǎng)分生長(zhǎng)擴(kuò)展，其擴(kuò)展速度顯著快于在皮層內(nèi)的擴(kuò)展速度；腐爛病菌在木質(zhì)部?jī)?nèi)的生長(zhǎng)擴(kuò)展主要受溫度、枝條含水量、木質(zhì)部的致密程度等因素的影響。