葉明旺，張春芝，黃三文,

（1云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/馬鈴薯科學(xué)研究院，昆明 650500；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518120）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界上最重要的塊莖類糧食作物，在解決全球糧食危機(jī)方面發(fā)揮著重要的作用。栽培馬鈴薯主要為同源四倍體，但四倍體遺傳的復(fù)雜性和薯塊繁殖的缺陷制約了馬鈴薯的遺傳改良。因此，越來越多的科學(xué)家呼吁進(jìn)行馬鈴薯的再馴化，在二倍體水平將馬鈴薯馴化成種子繁殖的作物[1-3]。在自然界中，二倍體馬鈴薯資源是非常豐富的。馬鈴薯包含228個(gè)野生種和7個(gè)栽培種，其中70%的野生種和4個(gè)栽培種為二倍體（Solanum ajanhuiri、S. phureja、S.stenotomumsubsp.stenotomum和S. stenotomumsubsp.goniocalyx）[4]。這些二倍體原始栽培種在品質(zhì)和抗性方面具有很多優(yōu)異的等位基因。近年來，不同馬鈴薯基因組的公布及變異組研究為挖掘這些二倍體栽培種中蘊(yùn)含的優(yōu)良等位基因提供了基因組學(xué)基礎(chǔ)[5-9]。為了克隆二倍體栽培種中的優(yōu)良等位基因并將其應(yīng)用于精準(zhǔn)育種，有必要建立高效的二倍體馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系。【前人研究進(jìn)展】四倍體馬鈴薯的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系比較成熟。早在1983年，OOMS等[10]就成功建立了四倍體馬鈴薯品種“Maris Bard”的遺傳轉(zhuǎn)化體系。隨后的幾十年間，四倍體馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化體系被不斷優(yōu)化[11-14]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到馬鈴薯重要基因的功能研究中[15-17]。另外，通過遺傳轉(zhuǎn)化對四倍體馬鈴薯進(jìn)行品質(zhì)和抗病性的改良也取得了很大的進(jìn)展[18-19]。目前，辛普勞公司已經(jīng)推出了第二代轉(zhuǎn)基因馬鈴薯Innate 2，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對4個(gè)性狀進(jìn)行了改良：提高了晚疫病抗性、降低了褐化程度、減少了低溫儲(chǔ)藏過程中產(chǎn)生的還原糖含量以及油炸后丙烯酰胺含量（http://www.simplot.com/）。隨著基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展，利用基因組編輯改良四倍體馬鈴薯的品質(zhì)也取得了一系列進(jìn)展[20-22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】相比之下，二倍體馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的研究較少，僅有少數(shù)基因型進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的摸索[23-25]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過篩選預(yù)處理培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)再生的激素比例、抗生素濃度等，建立二倍體原始栽培種的遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用篩選出的最佳體系對其他基因型進(jìn)行測試，分析不同基因型對轉(zhuǎn)化效率的影響，并分析再生植株的染色體加倍情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

試驗(yàn)所用的二倍體馬鈴薯原始栽培種均由國際馬鈴薯中心（International Potato Center，CIP）提供（表1）。所有的組培苗均于2016年7月于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所功能基因課題組組培間培養(yǎng)。采用MS 培養(yǎng)基（4.43 g·L-1MS 粉末、30 g·L-1蔗糖和 7 g·L-1瓊脂，pH=5.8）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度（19±1）℃，光照強(qiáng)度為2 000—3 000 lx，16 h光照，8 h黑暗。

所用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為EHA 105，內(nèi)含將pKSE401用EcoRⅠ單酶切插入35S-GFP-Terminal片段的pKSE402質(zhì)粒（pKSE401質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍教授提供），pKSE402質(zhì)粒上主要攜帶了GFP和卡那霉素抗性基因。

表1 試驗(yàn)所用的二倍體馬鈴薯材料Table 1 The diploid potato clones used in this study

表2 遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基配方Table 2 Mediums used genetic transformation

1.2 菌液的制備

挑取含pKSE402質(zhì)粒的單個(gè)農(nóng)桿菌菌落，接種于含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，置于搖床28℃，220 r/min，黑暗條件下，過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將農(nóng)桿菌收集到50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min。棄上清，用液體MS培養(yǎng)基（含40 mg·L-1乙酰丁香酮）（表2）進(jìn)行重懸，OD600值調(diào)整到0.6，用于后續(xù)浸染。

1.3 預(yù)培養(yǎng)

取苗齡為4周的無菌苗，切取不帶腋芽的莖段，置于A1培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（表2），預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為0、1、2、3和4 d，光照條件同上。每個(gè)預(yù)培養(yǎng)處理120個(gè)外植體，共600個(gè)外植體。

1.4 菌液浸染與共培養(yǎng)

將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的莖段收集，在提前備好的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10 min，期間搖晃幾次，使農(nóng)桿菌與莖段充分接觸，浸染結(jié)束后，用漏勺把菌液瀝干，之后將外植體置于三層濾紙上吸干菌液。吸干農(nóng)桿菌菌液后把外植體轉(zhuǎn)入覆蓋了一張無菌濾紙的 A2培養(yǎng)基（表2）中于黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)溫度為28℃。

1.5 外植體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

將經(jīng)過共培養(yǎng)莖段分別置于CIM1、CIM2、SIM1和SIM2中進(jìn)行培養(yǎng)（表2），2周換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)4周后，CIM1和CIM2都均勻更換為SIM1和SIM2，而最初在SIM1和SIM2上培養(yǎng)的維持不變。每個(gè)處理200個(gè)外植體，共800個(gè)外植體。

1.6 誘導(dǎo)愈傷和分化的抗生素篩選

將共培養(yǎng)2 d的外植體置于含有不同濃度卡那霉素（0、50、75、100 和 150 mg·L-1）的 SIM2 上誘導(dǎo)愈傷，2周更換一次培養(yǎng)基直至出芽。每個(gè)處理 100個(gè)外植體，共500個(gè)外植體。

1.7 生根培養(yǎng)時(shí)抗生素濃度的篩選

取未轉(zhuǎn)化的帶腋芽的外植體扦插至含有不同濃度卡那霉素（0、50、75、100和150 mg·L-1）的RIM上進(jìn)行生根處理。每個(gè)處理3瓶，每瓶8株。

1.8 篩選適宜遺傳轉(zhuǎn)化的基因型

利用篩選好的條件：預(yù)培養(yǎng) 2 d和添加了 100 mg·L-1Kan的篩選再生培養(yǎng)基 CIM1+SIM1、CIM1+SIM2、CIM2+SIM1、CIM2+SIM2、SIM1+SIM1以及SIM2+SIM2對其余17份二倍體馬鈴薯進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，每組處理100個(gè)外植體，共600個(gè)外植體。

1.9 生根培養(yǎng)

待獲得的再生芽長至1—2 cm時(shí)，將再生芽切下，扦插至RIM（50 mg·L-1卡那霉素）上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.10 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測和倍性檢測

設(shè)計(jì)包含綠色熒光蛋白的外源片段的擴(kuò)增引物對再生植株進(jìn)行擴(kuò)增（引物為F：5′-AAAAGGCCCCTG GGAATCTG-3′和 R：5′-AATTGAACGCCGAAGAA CAG-3′），擴(kuò)增條帶大小為320 bp。PCR體系為10 ng模板 cDNA、10 μL 2×GoTaq Colorless Master Mix 和正反向引物各 0.4 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35次循環(huán)；72℃ 1 min，4℃保存。

參照施春暉等[26]方法，利用北京大學(xué)鳳凰工程高通量流式平臺(tái) BD Fortessa流式細(xì)胞儀檢測陽性植株倍性樣品。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定

為了確定最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間，設(shè)置 5個(gè)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間梯度0、1、2、3和4 d。不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間處理的外植體經(jīng)過同樣的浸染和共培養(yǎng)之后，通過體視熒光顯微鏡進(jìn)行熒光采集和統(tǒng)計(jì)。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間在2 d以下時(shí)，莖段傷口處熒光團(tuán)面積會(huì)隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間顯著增加，但是隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步增加，浸染效率開始減小，直至第4天，只有少數(shù)幾個(gè)外植體上出現(xiàn)熒光小點(diǎn)（表 3）。因此確定最佳的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

表3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響Table 3 The effects of pre-culture time on transformation

2.2 不同激素配比對誘導(dǎo)愈傷組織和再生的影響

外植體經(jīng)過2 d的預(yù)培養(yǎng)后用菌液進(jìn)行浸染，共培養(yǎng)2 d后，將外植體分別轉(zhuǎn)移到CIM1、CIM2、SIM1和SIM2中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4周后，觀察愈傷組織的狀態(tài)，SIM2誘導(dǎo)愈傷組織的效率最高，且愈傷組織比較致密，呈深綠色，另外3種培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織較松散，呈淺綠色（表 4）。之后把 CIM1和 CIM2上的外植體均勻更換至SIM1和SIM2，進(jìn)行誘芽處理，SIM1和SIM2上的外植體維持原激素比例不變，每2周換一次培養(yǎng)基直至出芽，統(tǒng)計(jì)不同激素組合的再生情況（表5）。其中，SIM2+SIM2組合誘導(dǎo)再生芽的能力較強(qiáng)，有些外植體上有多個(gè)再生芽，因此，確定SIM2+SIM2為誘導(dǎo)二倍體馬鈴薯材料CIP 703541的最佳激素配比。

2.3 不同抗生素濃度對再生和生根的影響

利用篩選出來的最佳培養(yǎng)基組合SIM2+SIM2，對愈傷誘導(dǎo)和芽再生階段的抗生素濃度進(jìn)行篩選。外植體通過2 d預(yù)培養(yǎng)，經(jīng)浸染和共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至含有不同卡那霉素濃度的SIM2培養(yǎng)基上，8周后進(jìn)行對再生芽的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表6）。當(dāng)卡那霉素濃度在100 mg·L-1以下時(shí)，對馬鈴薯的出芽影響并不是很明顯。而當(dāng)卡那霉素濃度為100 mg·L-1的時(shí)候，部分外植體的出芽明顯被抑制，而且能夠出芽的外植體以單芽為主。當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到150 mg·L-1時(shí)，外植體經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，基本趨于死亡狀態(tài)，沒有獲得再生芽。因此，選擇濃度為100 mg·L-1的卡那霉素作為篩選二倍體馬鈴薯材料CIP 703541遺傳轉(zhuǎn)化的最適濃度。

野生型馬鈴薯帶腋芽的莖段扦插在添加了不同濃度卡那霉素的RIM培養(yǎng)基中進(jìn)行生根試驗(yàn)，在卡那霉素達(dá)到 50 mg·L-1時(shí)，所有的馬鈴薯植株已經(jīng)不能生根。因此，采用50 mg·L-1作為CIP 703541生根階段的卡那霉素篩選濃度。

表4 不同激素配比對莖段的愈傷組織誘導(dǎo)情況Table 4 Effects of different hormone ratios on callus induction

表5 不同激素配比對愈傷組織分化的影響Table 5 Effects of different hormone ratios on callus regeneration

表6 不同卡那霉素濃度對再生的影響Table 6 Effects of different kanamycin concentrations on regeneration

2.4 其他二倍體馬鈴薯材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系的篩選

根據(jù)建立的二倍體馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系的篩選流程，通過對另外17份二倍體原始栽培種進(jìn)行同樣的遺傳轉(zhuǎn)化篩選試驗(yàn)。其中，有 3份材料（CIP702961、CIP 703308和CIP 703312）能夠?qū)υO(shè)置的激素組合作出響應(yīng)，但是最適的激素組合不同（表 7）。其中，CIP 703308和CIP 703312誘導(dǎo)再生芽效率較高，分別為45%和40%。

2.5 轉(zhuǎn)基因陽性植株的鑒定

通過不用的激素組合篩選，獲得3份再生率較高的二倍體原始栽培種（CIP 703308、CIP 703312和 CIP 703541），根據(jù)每份材料最適的激素組合分別進(jìn)行大規(guī)模的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的外植體數(shù)分別為1 600、1 300和1 800個(gè)。將獲得的再生芽在卡那霉素濃度為50 mg·L-1的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行了兩輪生根測試（圖1-a和圖1-b），每一輪生根測試均淘汰一批不能正常生根的再生苗，最終分別獲得44、55和96株抗篩陽性植株，轉(zhuǎn)化效率分別為2.8%、4.2%和5.3%。經(jīng)PCR檢測，所有植株均含有外源載體序列。同時(shí)利用體視熒光顯微鏡對陽性植株的 GFP熒光進(jìn)行觀察，未轉(zhuǎn)化的植株由于葉綠體自發(fā)熒光呈現(xiàn)紅色，而陽性植株的葉片呈現(xiàn)紅綠相間的顏色，表皮毛的綠色比較明顯（圖1-c和圖1-d）。但是由于GFP在不同株系的表達(dá)情況不同，很難通過GFP的顏色準(zhǔn)確判斷是否是陽性植株，因此，以是否能夠經(jīng)過兩輪生根測試作為判斷陽性植株的標(biāo)準(zhǔn)。

表7 另外17份二倍體馬鈴薯原始栽培種的遺傳轉(zhuǎn)化體系篩選Table 7 Screening of optimal genetic transformation system for another 17 diploid landraces

圖1 轉(zhuǎn)基因陽性植株的檢測Fig. 1 Assays of the positive regenerated seedlings

2.6 轉(zhuǎn)基因陽性植株的倍性鑒定

馬鈴薯在經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化之后容易發(fā)生染色體加倍的現(xiàn)象。從轉(zhuǎn)化率較高的3份材料中（CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541），分別選擇部分陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行染色體倍性的檢測。結(jié)果顯示，大多數(shù)陽性植株為四倍體，其中CIP 703541的陽性植株中二倍體植株的比例最高，為38.46%（表8）。

表8 陽性植株的倍性檢測Table 8 Ploidy of positive transformants

3 討論

馬鈴薯的再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率受基因型的影響較大。HEERES等[27]對 16份四倍體材料進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)不同基因型對激素的響應(yīng)不同，誘導(dǎo)再生芽的效率差異也比較大。本研究利用6個(gè)激素組合對18份二倍體原始栽培種進(jìn)行了篩選，也獲得相同的結(jié)論。不同二倍體基因型的再生能力差異很大，而且再生能力強(qiáng)的基因型所響應(yīng)的激素組合也不同。本研究獲得3份再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率較高的二倍體資源。但是，其余大部分二倍體材料對6種激素組合均不響應(yīng)，因此，有必要對更多的二倍體基因型進(jìn)行激素配方篩選，然后通過全基因組關(guān)聯(lián)分析或者構(gòu)建分離群體的方法挖掘馬鈴薯中控制再生的遺傳位點(diǎn)，將有效解決基因型對再生和遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

無性系變異是植物組織培養(yǎng)中的一個(gè)常見現(xiàn)象[28-29]，它能在離體培養(yǎng)的細(xì)胞、愈傷或組織中發(fā)生，從而引起再生植株遺傳或者表觀遺傳的變異。本研究發(fā)現(xiàn)二倍體馬鈴薯經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化得到的再生苗里面染色體加倍的情況比較嚴(yán)重。在檢測的3份材料里，四倍體的概率均高于二倍體，其中CIP 703308的陽性轉(zhuǎn)化株中二倍體的概率僅為 5.26%。這意味著需要進(jìn)行大規(guī)模的遺傳轉(zhuǎn)化才能得到一定數(shù)目的二倍體陽性株。因此，在今后的研究中有必要篩選染色體加倍比例較低的二倍體。

二倍體馬鈴薯原始栽培種在南美洲已經(jīng)經(jīng)歷了幾千年的馴化和改良，除了在外觀、產(chǎn)量和適應(yīng)性方面與現(xiàn)在的四倍體栽培種還存在一些差距，其他很多性狀已經(jīng)接近現(xiàn)在的四倍體栽培種，因此，這些資源可以作為二倍體馬鈴薯育種的原始材料。通過對外觀、產(chǎn)量和適應(yīng)性等性狀進(jìn)行遺傳分析，挖掘控制這些性狀的遺傳位點(diǎn)，可以對二倍體原始栽培種進(jìn)行定向改良。本研究建立的高效轉(zhuǎn)化體系將為驗(yàn)證重要基因的功能以及利用生物技術(shù)對二倍體原始栽培種進(jìn)行遺傳改良提供有力工具。

4 結(jié)論

通過對 18份二倍體馬鈴薯栽培種進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的摸索，成功建立了其中3份材料的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。證實(shí)了二倍體馬鈴薯的再生能力和遺傳轉(zhuǎn)化效率也受基因型的較大影響，此外其再生植株很容易發(fā)生染色體加倍的情況。