朱健偉 李益飛 王兆濤 賈偉強 陳晨 顧應江 胡蓉 徐如祥

小腦作為掌管運動平衡、協(xié)調隨意運動、維持步態(tài)姿勢的重要中樞被人們所熟知，這與其結構密切相關。小腦皮層由蒲肯野細胞層（purkinje cell layers，PL）及其外側的分子層（molecular layers，ML）和內側的顆粒細胞層（granule cell layers，GCL）共同構成一個“三明治樣”的結構，蒲肯野細胞的胞體平行排列于PL，其發(fā)出的樹突分支延伸到ML，而其軸突則延伸到有顆粒細胞構成的GCL。此外，在蒲肯野細胞的胞體周圍還定居著伯格曼膠質細胞，其胞體位于PL，而膠質纖維則延伸到ML[1]。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一種跨膜類識別受體，在先天性免疫反應中具有重要的信號轉導作用，并且在中樞神經系統(tǒng)的炎癥反應和神經免疫性疾病中都有重要的作用，而Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）在這其中發(fā)揮著主導作用[2-4]。曾有研究證實，TLR4在中樞神經系統(tǒng)中主要表達于小膠質細胞中，然而近年來TLR4逐漸被發(fā)現(xiàn)在神經前體細胞（neural progenitor cells，NPCs）和神經元中均有表達，其作用涵蓋了神經性疼痛、神經退行性病變的發(fā)生發(fā)展以及神經可塑性，并且參與了成年海馬區(qū)的神經發(fā)生[5-11]。然而上述研究主要集中于中樞神經系統(tǒng)的大腦部分，對TLR4在小腦中的作用卻未曾闡述。因而，本研究主要通過免疫熒光染色的方法率先探索TLR4在小腦組織中的表達，為后期揭示TLR4在小腦功能中的作用提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物及分組管理

選取6月齡大小的TLR4基因敲除（TLR4-/-）小鼠及其同窩對照的野生型（TLR4+/+）小鼠作為研究對象。TLR4-/-小鼠購自南京大學動物模式中心，經與野生型小鼠雜交后得到雜合子（TLR4+/-）小鼠。然后通過TLR4+/-小鼠交配繁殖得到實驗所用的TLR4-/-小鼠及其同窩對照的TLR4+/+小鼠。所有小鼠均飼養(yǎng)于12 h晝夜周期的標準SPF級實驗動物房內，且給予充足的水和食物。

二、實驗試劑及儀器

TLR4抗體ab13556（Abcam公司，美國）；鈣結合蛋白抗體300（Swant公司，瑞士）；離子鈣接頭蛋白（ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1） 抗體ab5076（Abcam公司，美國）；性別決定區(qū)Y盒2號蛋白（sex determination region Y-box 2，Sox2）抗體 sc-17320（Santa Cruz公司，美國）；神經元特異核蛋白（neuron specific nuclear protein，NeuN）抗體ab104224（Abcam 公司，美國）。 萊卡冰凍切片機（CM1950，德國）；萊卡激光共聚焦顯微鏡（TCS SP5，德國）。

三、實驗動物分組管理

實驗所用小鼠根據(jù)DNA鑒定結果分為TLR4-/-組和TLR4+/+組，TLR4+/+組小鼠小腦組織用于抗體陽性染色，而TLR4-/-組小鼠小腦組織作為抗體陰性對照染色。

四、標本制備

6月齡大小的小鼠，經3.6%的水合氯醛麻醉后心臟灌注磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），待全身血液被置換出以后給予4%的多聚甲醛灌注。完整取出小鼠腦組織并放入4%的多聚甲醛溶液中置于4℃下后固定，24 h后用蔗糖溶液（10%、20%、30%）進行梯度脫水。分離小腦組織，以25 μm的厚度進行冰凍切片，并收集于載玻片上。

五、免疫熒光染色

冰凍切片于空氣中干燥15 min后，放入PBS溶液中搖晃清洗5 min，后放入含有0.3%辛基酚聚氧乙烯醚溶液的PBS中搖晃10 min×3次，隨即用10%的胎牛血清溶液于室溫下封閉1 h。棄去封閉液后加入稀釋好的一抗液（TLR4、鈣結合蛋白、Iba-1、Sox2、NeuN 等一抗）于 4℃下孵育 16～18 h，PBS搖晃清洗后加入稀釋好的二抗溶液并于室溫下孵育1 h。PBS 搖晃清洗 10 min×3 次， 用 4’，6-二脒基-2-苯基吲 哚 （4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）封 片 劑進行封片，而后于激光共聚焦下拍攝獲取一抗表達的熒光圖像，并分析TLR4的細胞定位及其與不同細胞Marker的共定位。

結 果

一、TLR4高表達于小腦蒲肯野細胞層

通過免疫熒光染色的方法，可發(fā)現(xiàn)TLR4在小腦組織中高表達于PL，而在ML和GCL中則沒有明顯的表達。而后通過與蒲肯野細胞特異的標記蛋白——鈣結合蛋白共染發(fā)現(xiàn)TLR4高表達于鈣結合蛋白陽性的蒲肯野細胞胞漿中，而在樹突分支中則沒有表達。詳細信息見圖1。

圖1 免疫熒光染色檢測Toll樣受體4在小腦蒲肯野細胞中的表達

二、TLR4在伯格曼膠質細胞和小腦顆粒細胞中的表達

通過免疫熒光共染，發(fā)現(xiàn)Sox2陽性的伯格曼膠質細胞（圖2）和NeuN陽性的顆粒細胞中均沒有TLR4 的表達（圖 3）。

三、TLR4在小腦小膠質細胞中的表達

將TLR4與小膠質細胞特異的標記蛋白——Iba-1進行共染，結果發(fā)現(xiàn)只有極少部分的小腦小膠質細胞表達TLR4（圖4）。

四、TLR4在TLR4-/-小鼠小腦組織中的表達

采用TLR4-/-的小腦組織進行陰性對照染色，結果發(fā)現(xiàn)TLR4抗體在TLR4-/-的小腦組織中未見明顯陽性表達信號（圖5）。

討 論

圖2 免疫熒光染色檢測Toll樣受體4在小腦伯格曼膠質細胞中的表達；圖3免疫熒光染色檢測Toll樣受體4在小腦顆粒細胞中的表達；圖4免疫熒光染色檢測Toll樣受體4在小腦小膠質細胞中的表達

圖5 免疫熒光染色檢測Toll樣受體4在TLR4-/-小腦組織中的表達

TLR4不僅是免疫調節(jié)的關鍵分子，同時也是調節(jié)中樞神經系統(tǒng)功能的重要分子，其廣泛參與神經性疼痛以及神經退行性病變[9，10]。通過減輕炎癥反應，TLR4還能夠保護缺血性損傷所致的海馬神經元凋亡，參與海馬區(qū)的神經可塑性調節(jié)和神經發(fā)生[7，11，12]。 這些研究揭示了 TLR4 在神經系統(tǒng)中的非免疫性功能，且一定程度上預示了TLR4在神經系統(tǒng)功能發(fā)揮中的重要作用，然而以上研究主要集中于中樞神經系統(tǒng)的大腦部分，對于小腦的研究卻未曾被揭示。

小腦的功能主要是調節(jié)運動平衡和協(xié)調動作的執(zhí)行，而這其中最關鍵的細胞是蒲肯野細胞，是小腦皮層中唯一的信號輸出神經元，對于小腦功能的執(zhí)行有著不可替代的作用[13-16]。本實驗率先發(fā)現(xiàn)了TLR4高表達于小腦的蒲肯野細胞中，這預示了TLR4在小腦功能執(zhí)行中可能發(fā)揮了重要的作用。蒲肯野細胞的胞體位于PL，然其樹突發(fā)出的分支卻伸向ML，遠端的樹突分支與顆粒細胞軸突上行到分子層形成平行纖維-蒲肯野細胞突觸連接；而近端樹突分支則與延髓橄欖核發(fā)出的攀緣纖維形成攀緣纖維-蒲肯野細胞突觸連接。蒲肯野細胞通過以上兩種突觸連接接收興奮性信號的輸入，經整合之后輸出到前庭小腦核和深部小腦核，以完成小腦功能的執(zhí)行[17]。因此，顆粒細胞對于蒲肯野細胞為核心的小腦功能執(zhí)行也有著重要的作用。而在小腦的PL中，伯格曼膠質細胞作為蒲肯野細胞的“鄰居”，其發(fā)出的膠質纖維進入ML與蒲肯野細胞的樹突分支緊密連接，形成支架樣的作用供蒲肯野細胞樹突分支的延伸，進而保證蒲肯野細胞充分的突觸連接以發(fā)揮其功能，因此伯格曼膠質細胞對于蒲肯野細胞的功能執(zhí)行也有著非常重要的作用[18]。本實驗同樣分析了TLR4在顆粒細胞和伯格曼膠質細胞中的表達，結果證實TLR4并沒有表達于顆粒細胞和伯格曼膠質細胞中。初步判斷TLR4在小腦功能執(zhí)行中的作用主要是通過影響蒲肯野細胞來實現(xiàn)的。

先前大量研究證實，TLR4作為免疫反應過程中的信號轉導蛋白，在小膠質細胞中表達。本實驗同樣分析了TLR4在小腦小膠質細胞中的表達，結果顯示只有極少部分的小膠質細胞中有TLR4的表達，這說明TLR4在小腦中的作用可能并未明顯涉及到免疫相關，反而其非免疫性的神經功能值得更深入的研究。為了進一步證實，筆者采用了TLR4-/-的小腦組織進行對照染色，結果發(fā)現(xiàn)TLR4抗體在TLR4-/-的小腦組織中未見明顯陽性表達信號，這既驗證了所用抗體的特異性，也證實了以上結果的可靠性。

綜上所述，本研究將免疫反應調節(jié)中的經典信號分子TLR4進行了小腦組織學表達情況的初步探索，明確了其高表達于蒲肯野細胞，這對于后期揭示其在小腦功能中的作用具有重要的啟示作用，同時對于探索TLR4在神經系統(tǒng)中的非免疫性作用也有重要的意義。