李浩然 ，李哲 ，孟凡生 **，劉世霞

（1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.沂水縣畜牧局，山東 沂水 276403）

雞傳染性支氣管炎病毒 (Chicken infectious bronchitis virus，IBV)，屬冠狀病毒科，冠狀病毒屬的病毒，具有多形性，所引起的疾病是廣泛流行的一種高度接觸性傳染病。目前，雖然已從鴿子和野雞中分離到IBV，但公認(rèn)雞是IBV主要宿主，可對(duì)不同日齡的雞產(chǎn)生不同程度的危害。IBV由于毒株不同分為呼吸性、腎性等10～15型。雞腎型傳染性支氣管炎(infectious bronchitis，NIB)是由嗜腎型傳染性支氣管炎病毒 (infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高致死性、接觸傳染的呼吸道傳染病,腎臟損傷嚴(yán)重，而呼吸道損傷較輕，以腎臟腫大呈蒼白色及腎小管內(nèi)尿酸鹽沉積為主要特征。雞感染IBV的腎性毒株后，會(huì)發(fā)生間質(zhì)性炎和呼吸道輕微癥狀，伴有中高程度的死亡率，在沒(méi)有繼發(fā)感染的情況下，病雞死亡率一般較低。美國(guó)學(xué)者Winterfield R W等[1]于1962年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并分離到能引起雞腎病變的IBV，1982年鄺榮祿等[2]首次報(bào)道在我國(guó)廣東發(fā)現(xiàn)NIBV。1999年，何長(zhǎng)生等[3]從以腎腫大或花斑樣腎的呼吸道疾病病例中分離到一株IBV。隨后,國(guó)內(nèi)20多個(gè)省市相繼報(bào)道有NIB發(fā)生[4]。

1 山東臨沂地區(qū)禽病流行情況

山東為全國(guó)的家禽養(yǎng)殖大省，而臨沂是山東省主要的家禽養(yǎng)殖基地，以肉雞、蛋雞和水禽為主。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)[5]，目前臨沂市禽病主要以新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊炎為主的病毒病。其中，以傳染性支氣管炎為例，與往年相比，發(fā)病明顯減少，肉雞僅在春天有一定發(fā)病比例，蛋雞在開產(chǎn)前有零星發(fā)病情況，但一般不嚴(yán)重，致死率較以前相比，明顯下降。

2 材料

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2.1.1 發(fā)病雞只 山東臨沂地區(qū)4處雞場(chǎng)40日齡自然發(fā)病、臨床上疑似腎型雞傳染性支氣管炎病死雞 120 只， 編號(hào) A1-A30、B1-B30、C1-C30、D1-D30。

2.1.2 SPF雞胚 試驗(yàn)用 9～12日齡的 SPF雞胚200枚，購(gòu)自山東省某家禽研究所。

2.2 試驗(yàn)主要儀器及藥品

2.2.1 試驗(yàn)儀器 電泳儀：無(wú)錫久平儀器有限公司，型號(hào)JY-SP12；紫外燈儀：南京順泰科技有限公司；基因擴(kuò)增儀：龍口市先科儀器公司，型號(hào)MG；單人凈化操作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)為SW-CJ-1FD；37℃恒溫箱：龍口市電路制造廠生產(chǎn)，型號(hào)為YY0027-90；臺(tái)式離心機(jī)：常州市凱航儀器有限公司,型號(hào)KA-1000；孵化機(jī)：北京方通孵化機(jī)公司，型號(hào)FT-XFC3。

2.2.2 試驗(yàn)藥品 胰蛋白酶：購(gòu)自上?？祆`生物科技有限公司，工作濃度為1.47%；雞紅細(xì)胞：采自江蘇某孵化場(chǎng)正常雞，工作濃度為0.9%；青霉素和鏈霉素：購(gòu)自魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，工作濃度為950IU；動(dòng)物疫病基因芯片診斷試劑盒：購(gòu)自濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司。

3 方法

3.1 臨床診斷與剖檢 觀察發(fā)病雞臨床癥狀，記錄典型癥狀。

3.2 病料采集處理 取病死雞A組氣管滲出物、病死雞B組肺組織、病死雞C組腎組織、病死雞D組血液，置于勻漿器中（除D組），加少量無(wú)菌生理鹽水研磨，制成1：4.5的懸液，反復(fù)凍融至少3次后，7800r離心35min，取上清液，加青霉素、鏈霉素各950IU，置 4℃過(guò)夜，備用；D組血液在 4℃靜置30min后，1500r離心5min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 雞胚傳代 處理液接種5日齡SPF初代雞胚，編號(hào)同發(fā)病雞只，尿囊腔接種，每一個(gè)胚胎0.2ml，在37℃孵化箱中孵化19d，孵化過(guò)程中每6h照蛋1次，24h內(nèi)死亡的雞胚丟棄，死胚尿囊液及時(shí)收集，盲傳3代，每一代在37℃孵化箱中孵化24h，孵化過(guò)程中每6h照蛋1次，24h內(nèi)死亡的雞胚丟棄，編號(hào)與A、B、C組病雞一一對(duì)應(yīng)。

3.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)

3.4.1 樣本要求 取3.2所述病料處理樣本。

3.4.2 RNA提取 ①取 被 測(cè) 樣 品 200μl，加550μl Tirzol裂解液，上下顛倒混勻，冰上靜置15min；②加1/5volum氯仿，顛倒混勻，冰上靜置15min，4℃，12000r離心 15min；③取上清液 500μl，加入500μl異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜置10min，4℃，12000r離心 15min；④棄上清液，加入75%的冷乙醇 1ml，14℃，12000r離心 5min，棄上清液，室溫靜置3min；⑤加入30μl ddH2O溶解沉淀，所得產(chǎn)物即為RNA溶解液。

3.4.3 反轉(zhuǎn)錄 采用20μl體系。

簡(jiǎn)單離心混勻，置于42℃環(huán)境內(nèi)孵育30min，產(chǎn)物置于4℃存放待用（若間隔時(shí)間較長(zhǎng)，-20℃保存）。

3.4.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 20μl體系。

簡(jiǎn)單離心混勻，置于PCR儀中。PCR儀循環(huán)參數(shù)按照以下設(shè)置∶

3.4.5 核酸電泳 ①50XTAE電泳液與ddH2O按1∶50的比例配1XTAE電泳液；②瓊脂糖與電泳液按1∶100的比例配制1%的瓊脂糖膠，倒板前加入7μl核酸染料；③室溫靜置 20min，待瓊脂糖膠凝固， 備用； ④取 PCR產(chǎn)物 8μl與 2μl Loading buffer，吹打混勻加入瓊脂糖凝膠孔；⑤樣品孔前孔加入 3μl 2000PlusⅡMarker；⑥電泳 20min；⑦電泳好的瓊脂凝膠放到紫外燈上觀察結(jié)果。

4 結(jié)果

4.1 臨床及剖檢觀察 發(fā)病雞群表現(xiàn)精神沉郁，下痢，羽毛凌亂，排白色石灰樣糞便，發(fā)病率65%，死亡率約7.5%。剖檢主要病理變化表現(xiàn)為腎腫大、顏色蒼白，呈菜花狀，切面呈“花斑”狀（圖1），腎小管內(nèi)充滿尿酸鹽結(jié)晶；氣管環(huán)輕微出血，氣囊渾濁變厚；輸尿管擴(kuò)張，內(nèi)有白色柱狀尿酸鹽；泄殖腔內(nèi)有大量乳狀尿酸鹽沉積，肝、肺、腔上囊和腺胃乳頭均正常。部分病、死雞可見(jiàn)氣管環(huán)出血,但無(wú)明顯粘液栓存在。

圖1 剖檢病死雞

4.2 雞胚傳代 病料處理液接種SPF雞胚后第一代 5d內(nèi)死亡 5枚；6～11d內(nèi)死亡 2枚，12～19d內(nèi)死亡3枚，胚體表面有散在出血點(diǎn)，初代接種雞胚，少數(shù)發(fā)育受阻(圖2），多數(shù)雞胚存活，符合本病毒特征。第2代接種后6h死亡3枚,7～12h死亡1枚，24h收獲1枚活胚，胚體表面有少量出血點(diǎn)。第3代接種后6h收獲1枚死亡胚，胚體后腦及背部有點(diǎn)狀出血。第4代接種后12h內(nèi)死亡2枚，24h收獲1枚活胚，胚體全身有出血點(diǎn)（圖3）。

圖3 收獲活胚，胚體表面有出血點(diǎn)

4.3 PCR 根據(jù)圖4凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)提取的病毒為IBV陽(yáng)性，即該病毒為雞腎型傳染性支氣管炎病毒。

圖4 PCR結(jié)果

5 防治

5.1 預(yù)防 加強(qiáng)雞場(chǎng)飼養(yǎng)管理，定期消毒，嚴(yán)格執(zhí)行隔離、檢疫等衛(wèi)生防疫措施。降低飼養(yǎng)密度，保持適宜溫度，減少各種應(yīng)激，合理配比飼料，防治維生素缺乏。

目前該病的預(yù)防疫苗主要有M41的弱毒苗，如H120、H52及多價(jià)滅活疫苗[15]。因?yàn)镮BV血清型多，各型間幾乎無(wú)交叉免疫，所以盲目引進(jìn)腎型IBV疫苗，有可能會(huì)起到適得其反的作用，一般認(rèn)為M41型對(duì)其他型病毒有交叉免疫作用，所以必須掌握流行的血清型，選擇和使用與當(dāng)?shù)氐难逍鸵恢碌囊呙缰辍120一般應(yīng)用于雛雞，因其毒力相對(duì)較弱，對(duì)雛雞更為安全；H52毒力較強(qiáng)，一般應(yīng)用于20日齡以上雞。在飼喂管理上，用玉米粉代替蛋白質(zhì)飼料以減輕腎臟的負(fù)擔(dān)，同時(shí)，小蘇打或電解質(zhì)飲水，2～3d后癥狀有所緩解。必要的時(shí)候也可以在飼料中添加主治該病的中藥，如黃芪、黨參、金銀花、連翹等。

為防止加重腎臟負(fù)擔(dān)，使死亡數(shù)量增加[6]應(yīng)避免使用有腎毒性的抗生素。提取病雞的病料分離病毒并用分離鑒定過(guò)的毒株做成自家苗在開產(chǎn)前和雛雞階段進(jìn)行免疫，能有效的預(yù)防感染IBV。

5.2 治療 對(duì)病雞主要是對(duì)癥治療和防止繼發(fā)感染，可使用廣譜抗生素如0.01%強(qiáng)力霉素或0.005%恩諾沙星飲水等，對(duì)腎型IBV除防止繼發(fā)感染外，可在飲水中加入水溶性多維素以及烏洛托品或含有檸檬酸鹽的復(fù)方藥物等，以保腎、補(bǔ)液，促進(jìn)尿酸鹽排出。對(duì)于嚴(yán)重病例，采取緊急措施，必要時(shí)應(yīng)及時(shí)淘汰。

6 總結(jié)和討論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)中所觀察的剖檢結(jié)果及通過(guò)各項(xiàng)鑒定數(shù)據(jù)方法所得的數(shù)據(jù)分析，確定分離所得病毒為雞腎型傳染性支氣管炎病毒，本實(shí)驗(yàn)中的主要病變?cè)谀I臟和呼吸道。腎病變型支氣管炎除呼吸器官病變外，可見(jiàn)腎腫大，腎小管內(nèi)尿酸鹽沉積而擴(kuò)張，腎呈花斑狀，輸尿管尿酸鹽沉積而變粗；心、肝和脾臟表面也有沉積的尿酸鹽似一層白霜；有時(shí)可見(jiàn)法氏囊有炎癥和出血癥狀；病雞排白色稀糞。但本病臨床診斷意義不大，應(yīng)注意同中毒性疾病、減蛋綜合征等其它疾病區(qū)分。

實(shí)驗(yàn)表明，腎型IBV呼吸道癥狀明顯，潛伏期約1～7d。然后雞出現(xiàn)了嚴(yán)重的腹瀉，甚至死亡，病程約21d。調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在腎型IBV流行特點(diǎn)主要是發(fā)生在2～6周齡以內(nèi)的雛雞，20%～45%的死亡率，呼吸道癥狀呈一過(guò)性。

本病目前還無(wú)特效療法的報(bào)道，因此，應(yīng)重視早期臨床癥狀觀察和流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)合解剖特征、分子生物學(xué)診斷，對(duì)疾病進(jìn)行早期控制；當(dāng)出現(xiàn)有疑似患病雞群時(shí)，應(yīng)及時(shí)采取治療措施，必要時(shí)進(jìn)行捕殺，防止病原擴(kuò)散，將危害程度最小化。