張文通 ，魏鳳 ，李峰 ，王金良 ，苗立中 ，沈志強(qiáng) ，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由副粘病毒引起的禽類的高度接觸性傳染病。該病呈世界性分布，又稱為亞洲雞瘟[1-3]。以高度呼吸困難、便稀、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血為主要特征[1-3]，具有較高的發(fā)病率和致死率，對養(yǎng)雞業(yè)危害嚴(yán)重。2018年4月，山東博興縣某雞場發(fā)生了以呼吸困難、拉綠色糞便及腺胃出血等特征的疑似雞新城疫疾病，現(xiàn)將診治療過程報(bào)告如下：

采用發(fā)病情況調(diào)查、臨床癥狀、病理剖檢、病原分離、RT-PCR診斷，確診病原為雞新城疫病毒。根據(jù)確診結(jié)果，按照雞新城疫病防治措施操作，雞場發(fā)病情況立即得到好轉(zhuǎn)。

1 發(fā)病情況

2018年4月初發(fā)現(xiàn)濱州博興縣某規(guī)模化蛋雞場（存欄約1萬只）有雛雞（2～3周齡）開始零星發(fā)病，兩三天波及全群，發(fā)病率達(dá)100%，病死率約30%。用抗生素治療無效。

2 臨床癥狀

呼吸困難，嗜睡，臥倒，拉綠色稀糞便；個(gè)別雛雞臨死前有神經(jīng)癥狀。

3 病理變化

剖檢病死雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：氣管有粘液，肺臟出血，肝臟出血、腺胃乳頭出血、淋巴結(jié)腫大出血，小腸出血。

4 病毒分離鑒定

4.1 病料采集 無菌取病死雞肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等。

4.2 病料處理 將采集的樣品，按照樣品與滅菌0.85%生理鹽水 1∶3比例研磨；反復(fù)凍融；4℃12000r/min離心10min；吸取上清，將上清液用0.22μm一次性濾器過濾除菌；分裝凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

4.3 病毒分離 用上述過濾除菌病料尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0.1ml，置36～37℃繼續(xù)孵育。孵育結(jié)果為，24h內(nèi)無死胚，收獲接種后24～120h死胚尿囊液，分裝。繼續(xù)在SPF雞胚上傳至3代，并收獲尿囊液備檢。

5 病毒的RT-PCR鑒定

5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank報(bào)道的“KF306265”序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增長度522bp，用于鑒定雞新城疫病毒。引物序列如下：

上游引物：ATGGGCTCCAGACCTTCTACT；

下游引物：TTGTGATAATCCGTCGGTGA。

5.2 病毒的RT-PCR 提取3代胚尿囊液的RNA，并同時(shí)提取新城疫陰性胚毒及新城疫陽性胚毒的RNA（新城疫陰性、陽性胚毒來自山東綠都生物科技有限公司）。病毒RNA用大連寶生物提供的RNA提取試劑盒提取，一步法RT-PCR反應(yīng)成分及反應(yīng)程序見表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄45min；94℃5min； 進(jìn) 入 PCR 循 環(huán) ，94℃ 45Sec，55℃ 45Sec，72℃ 45Sec，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸 10min。 反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

5.3 病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，病毒的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約522bp，與預(yù)期一致，見圖1所示。

圖1 病毒的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

回收RT-PCR產(chǎn)物，送往上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果與GenBank上報(bào)道的雞新城疫核苷酸序列同源性最高達(dá)99%。

5.4 治療措施 經(jīng)上述診斷確認(rèn)病原為雞新城疫病毒。建議雞場采取如下措施：①消毒及隔離措施。建議對發(fā)病雞舍與受威脅雞舍采取嚴(yán)格隔離措施，并進(jìn)行全面、定期消毒；②緊急接種措施。購買正規(guī)廠家的新城疫疫苗，對本場所有雞群進(jìn)行緊急免疫；③無害化處理措施。對病死雞，進(jìn)行深埋或其他無害化處理措施；④藥物輔助治療措施。建議對所有雞群采用對大腸桿菌敏感的抗生素進(jìn)行預(yù)防或治療，并給予Vc等藥物用于提高機(jī)體免疫力。

養(yǎng)雞場按照上述治療措施進(jìn)行操作，發(fā)病雞群死亡率及發(fā)病率大幅降低。2周后病情基本緩解，雞場進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)。

6 小結(jié)

通過與發(fā)病雞場廠長進(jìn)行溝通，該場進(jìn)行過新城疫疫苗免疫。但免疫之前，未進(jìn)行母源抗體測定，按經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行免疫接種。另外該場生物安全措施幾乎沒有，人員未經(jīng)消毒隨意進(jìn)入雞舍，總之管理混亂。雞舍內(nèi)部未定期消毒，雞舍環(huán)境較差。這三點(diǎn)可能是該場暴發(fā)雞新城疫病的原因。