肖龍敏，劉雪峰，張玉洲，王巖，薛煜

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊陵 712100； 2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省黑河市遜克縣道干林場(chǎng)，黑龍江 黑河 164499)

蒙古櫟Quercusmongolica是營(yíng)造防風(fēng)林、水源涵養(yǎng)林及防火林的優(yōu)良樹種，是國(guó)家二級(jí)珍貴樹種，也是中國(guó)東北林區(qū)主要次生林樹種及城市園景樹和行道樹樹種。蒙古櫟常常會(huì)被松櫟柱銹菌CronartiumquercuumBerk Miyabe侵染，葉子萎黃、枯落，給東北養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大損失，又可作為第二年初侵染源，加重松瘤銹病(Cronartiumquercuum)侵染[1-4]。

為了解不同地區(qū)感病蒙古櫟葉上真菌種群的組成和分布情況，找出各自優(yōu)勢(shì)種和建群種，為控制松櫟柱銹菌進(jìn)一步擴(kuò)散，開發(fā)和利用蒙古櫟資源提供依據(jù)。2014年作者在4個(gè)地區(qū)采集松櫟柱銹菌侵染的蒙古櫟葉片，分離、培養(yǎng)、鑒定其上的真菌種群，以期為進(jìn)一步研究和篩選松櫟柱銹菌的拮抗真菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 2014年春、秋季分別在大興安嶺塔河林業(yè)局、密山市興凱湖采集松櫟柱銹菌侵染的蒙古櫟越冬和當(dāng)年病葉，當(dāng)年秋季在黑龍江省五大連池朝陽(yáng)林場(chǎng)和內(nèi)蒙自治區(qū)扎賚特旗神山林場(chǎng)采集松櫟柱銹菌侵染的蒙古櫟當(dāng)年病葉；所采材料分別放入紙袋，帶回實(shí)驗(yàn)室置于冰箱4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 將蒙古櫟病葉樣本切成2 cm×2 cm小塊，用漂白粉1∶14倍液消毒3 min左右，取出用無菌水漂洗3次，用鑷子挑取葉片分別接種到PDA(配方：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)和玉米粉培養(yǎng)基(配方：玉米粉20 g，瓊脂17 g，水1 000 mL)上，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放5塊材料；各設(shè)5個(gè)重復(fù)。將接種后的培養(yǎng)皿倒置放入25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.2 菌種鑒定 待菌落形成后，挑取培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌，制成臨時(shí)玻片或永久玻片，在顯微鏡下觀察，記錄并統(tǒng)計(jì)各菌種出現(xiàn)的頻率(檢出率)、形態(tài)特征；并結(jié)合培養(yǎng)特性及菌落的特征，根據(jù)工具書和其它相關(guān)真菌分類學(xué)資料進(jìn)行種類鑒定[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大興安嶺地區(qū)蒙古櫟病葉真菌菌群種類與分布 大興安嶺地區(qū)蒙古櫟病葉上共分離真菌12屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離11屬(種)，玉米粉培養(yǎng)基上分離9屬(種)。

在PDA培養(yǎng)基上，越冬病葉和當(dāng)年病葉分離出的真菌存在差異，其中越冬葉上共分離出7屬(種)，檢出率最高的是鏈格孢，為36%，為該真菌群落的優(yōu)勢(shì)屬，其次為假絲酵母Candida和青霉屬Penicillium，分別為24%和12%；當(dāng)年病葉上共分離出7屬(種)，檢出率最高的是粉紅單端孢Trichotheciumroseum和毛霉屬M(fèi)ucor，同為20.0%，其次為木霉屬Trichoderma和鐮刀菌屬Fusarium，分別為16%和12%(表1)。

在玉米粉培養(yǎng)基上，越冬病葉和當(dāng)年病葉分離出的真菌也存在差異。其中越冬病葉上分離出4屬(種)，檢出率最高的是枝孢屬Cladosporiun，為40%，其次是鏈格孢，為16%；當(dāng)年病葉上共分離出6屬(種)，檢出率最高的是枝孢屬，為76%，其次是黑孢屬Nigrospora，為28%(表1)。說明環(huán)境情況、養(yǎng)分有可能會(huì)影響到真菌種群的生長(zhǎng)發(fā)育。

表1 大興安嶺地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟病葉上真菌群落分布情況

無論在PDA培養(yǎng)基還是玉米粉培養(yǎng)基上，鏈格孢都出現(xiàn)在越冬病葉上，說明該菌有可能是該生境真菌群落的后來者。在PDA培養(yǎng)基上無論越冬病葉還是當(dāng)年病葉，均可以分離到粉紅單端孢、鐮刀菌和青霉，表明這3種真菌都是該群落中的相對(duì)固定成員(表1)。

2.2 興凱湖地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌菌群種類與分布 興凱湖地區(qū)蒙古櫟當(dāng)年病葉上共分離到真菌11屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離6屬(種)，玉米粉培養(yǎng)基上分離5屬(種)；蒙古櫟越冬病葉上共分離到真菌10屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離9屬(種)，玉米粉培養(yǎng)基上分離5屬(種)。

越冬病葉上的真菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌絲繁茂，共分離出9屬(種)，檢出率最高的是鏈格孢，為60%，其次為粉紅單端孢為44%；當(dāng)年病葉上共分離出6屬(種)，檢出率最高的是青霉和毛霉屬，分別為68%和48%。當(dāng)年病葉的真菌檢出率普遍較高，在12%～68%之間(表2)。這與當(dāng)時(shí)的水分充沛，溫度適宜的環(huán)境條件有關(guān)。

在玉米粉培養(yǎng)基上，越冬病葉和當(dāng)年病葉分離出的真菌均為5個(gè)屬(種)，但種類不同。其中越冬病葉上真菌檢出率最高的是枝孢屬，為52%，其次是色串孢，為40%；當(dāng)年病葉上真菌檢出率最高的是枝孢屬為84%，其次是黑孢屬，檢出率為32%。鏈格孢雖然不是優(yōu)勢(shì)屬，但是該群落中的固定成員，無論是在不同培養(yǎng)基上，還是不同的生活環(huán)境中均以一定的頻率出現(xiàn)(表2)。

表2 興凱湖地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟病葉上真菌群落的分布情況

2.3 內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌菌群種類與分布 在內(nèi)蒙古神山林場(chǎng)蒙古櫟當(dāng)年生病葉上共分離出真菌8屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上共分離真菌6種，枝孢屬為優(yōu)勢(shì)屬，占68%，亞優(yōu)勢(shì)屬種為青霉屬、粉紅單端孢，均為20%。玉米粉培養(yǎng)基上共分離真菌5屬(種)，枝孢屬為優(yōu)勢(shì)屬，占60%，鏈格孢為亞優(yōu)勢(shì)屬，占32%，再其次為色串孢屬Torula(表3)。

所有真菌屬(種)在PDA培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)旺盛，而在玉米粉培養(yǎng)基上菌絲均稀疏，說明玉米粉培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不適于這些真菌生長(zhǎng)。

表3 內(nèi)蒙古地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟當(dāng)年病葉上真菌群落分布情況

續(xù)表

2.4 五大連池地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌菌群種類與分布 該地區(qū)共從蒙古櫟當(dāng)年病葉上分離到真菌6屬(種)，其中PDA培養(yǎng)基上分離5屬(種)，檢出率最高的是粉紅單端孢，為64%，其次為芽枝霉和青霉，分別為48%和20%，鏈格孢和附球孢均為12%；在玉米粉培養(yǎng)基上分離5屬(種)，檢出率最高的是粉紅單端孢，為68%，其次是色串孢和枝孢屬，分別為56%和44%(表4)。五大連池地區(qū)當(dāng)年生病櫟葉真菌種群數(shù)量較前3個(gè)地區(qū)低，這可能與當(dāng)?shù)氐男…h(huán)境有關(guān)；五大連池屬近代活火山口，植被種類不十分豐富及環(huán)境條件干燥。

同樣，生長(zhǎng)在玉米粉培養(yǎng)基上的真菌長(zhǎng)勢(shì)羸弱，而生長(zhǎng)在PDA培養(yǎng)基上的真菌長(zhǎng)勢(shì)旺盛。

表4 五大連池地區(qū)松櫟柱銹菌侵染蒙古櫟病葉上真菌群落分布情況

3 結(jié)論與討論

松櫟柱銹菌是一種轉(zhuǎn)主寄生菌，性孢子、春孢子階段生長(zhǎng)在樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica上，夏孢子、冬孢子階段生長(zhǎng)在蒙古櫟葉片上。作者通過對(duì)4個(gè)地區(qū)蒙古櫟病葉上真菌群落分布情況的研究，共分離得到18屬(種)真菌。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的越冬病葉和當(dāng)年生病葉上，真菌種群分布均有所不同，優(yōu)勢(shì)種也不同。這可能與當(dāng)?shù)丨h(huán)境以及病原菌自身特性有關(guān)。薛煜 等[4]通過對(duì)松櫟柱銹菌冬孢子萌發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，在松瘤銹病侵染循環(huán)中，冬孢子的侵染起著非常重要的作用。因冬孢子的壽命長(zhǎng)，萌發(fā)力可持續(xù)3個(gè)月左右，冬孢子在適宜的環(huán)境條件下幾乎全部萌發(fā)，萌發(fā)力高于銹孢子的60%，冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生的擔(dān)孢子還以產(chǎn)生次生擔(dān)孢子的形式來適應(yīng)不利的萌發(fā)環(huán)境。薛煜 等[7]研究表明，蒙古櫟展葉時(shí)，正是松櫟柱銹菌成熟時(shí)，為了保護(hù)自身的安全，增強(qiáng)防御病原菌和其他生物的侵襲，而產(chǎn)生大量乙烯，但也可能正是其發(fā)散出的大量乙烯，又給松櫟柱銹菌傳導(dǎo)了有新“獵物”的信息，從而促進(jìn)春孢子器成熟。Cristeseu 等[8]已證實(shí)植物受到病原微生物侵染后會(huì)在體內(nèi)積累大量乙烯，這說明寄主和病原菌之間是有化學(xué)感應(yīng)的。

蒙古櫟病葉在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離的真菌種類不同，優(yōu)勢(shì)種也存在區(qū)別。4個(gè)地區(qū)在PDA培養(yǎng)基上分離的真菌種群均比玉米粉培養(yǎng)基上多，這與真菌各屬(種)生活所需營(yíng)養(yǎng)條件和適宜的環(huán)境條件有關(guān)。大興安嶺地區(qū)，無論在PDA培養(yǎng)基還是玉米粉培養(yǎng)基上，在越冬病葉上都出現(xiàn)鏈格孢菌，說明該菌在該生境中不是真菌群落的早期成員，而是后期的葉片分解者。胡勤星 等[9]利用不同的碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈格孢屬真菌的7個(gè)種，表明7種鏈格孢菌的培養(yǎng)特征存在差異。許美玲 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，同一菌株在人工培養(yǎng)條件下的生態(tài)特性與外界環(huán)境條件下不完全相同，不論是溫度、pH值還是營(yíng)養(yǎng)條件，在自然條件下其生長(zhǎng)范圍更廣。于娟 等[11]對(duì)小興安嶺土壤表層真菌群落季節(jié)動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，土壤真菌的數(shù)量和種類受很多環(huán)境因素的影響，而林地內(nèi)的溫度、植被、土壤環(huán)境等因素都會(huì)隨著季節(jié)的變化而變化。

從黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)4個(gè)地區(qū)蒙古櫟病葉上分離培養(yǎng)得到的真菌中，粉紅單端孢出現(xiàn)的頻率很高。粉紅單端孢是全球分布的一種真菌，以腐生為主，兼具寄生。1809年Link于德國(guó)柏林首次發(fā)現(xiàn)該菌，是引起多種植物病害的重要病原真菌，同時(shí)也具有較大的生物防治潛力。營(yíng)金鳳 等[12]用粉紅單端孢菌株濾液對(duì)玉米小斑病(HelminthosporiummaydisNisik & Miy)孢子萌發(fā)作抑制試驗(yàn)，結(jié)果表明，粉紅單端孢TrC菌株濾液對(duì)玉米小斑病菌孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，處理2，4，8，12，24 h后，孢子萌發(fā)抑制率分別為37.5%，53.33%，66.15%，55.56%，0.65%；其中以處理后8 h的孢子萌發(fā)抑制率最高。另外，觀察發(fā)現(xiàn)，處理組萌發(fā)的孢子芽管較短，增粗、畸形。張世宏 等[13]培養(yǎng)粉紅單端孢誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的孢外幾丁質(zhì)酶，抗菌活性試驗(yàn)表明此純酶有抑制煙草赤星病菌Alternariaalternata、串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme，稻瘟病菌Magnaporthegrisea，棉花黃萎菌Verticilliumdahliae，輪紋病菌Macrophomaspp.等病原菌孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的作用，其中對(duì)棉花黃萎菌的抑制作用最強(qiáng)。此外，粉紅單端孢菌的弱寄生和土壤習(xí)居特點(diǎn)決定了該菌還可以分解土壤中的有機(jī)物質(zhì)，對(duì)于多種土傳和種傳植物病原菌有拮抗作用，所以粉紅單端孢又是一種重要的生防資源[14-17]。Urbasch[14,18]發(fā)現(xiàn)粉紅單端孢菌可以產(chǎn)生一種熱穩(wěn)定的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，具毒素作用，可以對(duì)寄主真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用?？傊?，粉紅單端孢菌是一種重要的生防菌，可以在多種病原上寄生，抑制病原菌的擴(kuò)展和危害，甚至殺死病原菌。