方 芳

(上海食品科技學(xué)校,上海 201599)

籽粒莧(AmaranthushypochondriacusL.)是莧科(Amaranthaceae)、莧屬(Amaranthus)一年生草本植物[1],是世界上最古老的作物之一[2]。它曾經(jīng)是古代印第安人的主食之一,現(xiàn)已廣泛種植于中美洲、亞洲和歐洲[3]。籽粒莧是一種營養(yǎng)價值很高,并兼?zhèn)浼Z、菜、飼料、觀賞等多種用途的作物[4]。籽粒莧產(chǎn)籽量高,籽實富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素等。此外,它還含有多種生理活性成分,如多酚、黃酮等[5-6]。

蒸汽爆破技術(shù)作為一種經(jīng)濟(jì)、有效、無污染的前處理方式,目前已經(jīng)廣泛用于處理植物原料,如木質(zhì)素[7]、麥麩[8]、大蒜[9]、竹莖[10]等。它的基本原理是,在高溫高壓環(huán)境下,過熱液體充滿原料孔隙,當(dāng)瞬間釋放壓力,液體迅速氣化,原料體積急劇膨脹而使細(xì)胞“爆破”,小分子物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)釋放[11]。汽爆后,纖維素和半纖維素呈現(xiàn)不同程度的降解,有利于結(jié)合態(tài)酚酸的釋放。龔凌霄[11]、劉翀[12]、趙夢麗[13]等均發(fā)現(xiàn)蒸汽爆破有利于原料酚酸釋放和抗氧化能力的提高。

籽粒莧籽實作為一種優(yōu)質(zhì)的糧食來源,應(yīng)用前景廣闊。目前,尚未有關(guān)于籽粒莧籽實蒸汽爆破處理后,研究其活性成分及抗氧化能力的報道。本文探索了蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實抗氧化活性成分及抗氧化能力的影響,為充分有效地利用籽粒莧籽實資源提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

籽粒莧籽實 品種R104,收獲于2017年8月,購于上海牧良實業(yè)有限公司;Folin-酚試劑 純度>98%,華東醫(yī)藥股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 純度>98%,源葉生物科技有限公司;2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶三吖嗪(TPTZ) 純度>98%,青島美倫生物科技有限公司;蘆丁、對羥基苯甲酸、硫酸亞鐵 純度>98%,上海阿拉丁試劑有限公司;硝酸鋁、亞硝酸鈉、過硫酸鉀 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

QBS-80型蒸汽爆破機 河南鶴壁正道生物能源有限公司;QE-100型屹立牌粉碎機 武義縣屹立工具有限公司;Bio Tek EON型酶標(biāo)儀 美國博騰(BioTek)儀器有限公司;HH-ZK6型恒溫水浴鍋 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;3K15型臺式冷凍離心機 德國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 籽粒莧籽實蒸汽爆破預(yù)處理 籽粒莧籽實采后自然風(fēng)干,用蒸餾水浸泡5 h,一部分放入蒸汽爆破機物料倉中,通入飽和蒸汽,壓力選取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 MPa,時間選取10、20、30、60、120 s,在極短的時間內(nèi)完成泄壓(閥門打開時間0.00875 s),實現(xiàn)蒸汽爆破[14];另一部分未作處理,為空白對照。將處理后的樣品收集,自然風(fēng)干,置于避光通風(fēng)處,待分析。

1.2.2 籽粒莧籽實提取液制備 將上述籽粒莧籽實樣品粉碎,過80目篩,精密稱取1.0000 g粉末于50 mL三角瓶,按照料液比1∶30 (w/w)比例加入50%乙醇,70 ℃水浴攪拌浸提30 min,將提取液冷卻,4800 r/min離心10 min,提取上清液,待測。

1.2.3 總酚含量測定 參考方芳[15]方法并稍作調(diào)整。準(zhǔn)確稱取經(jīng)0.1 MPa,70 ℃真空干燥至恒重的對羥基苯甲酸25.0 mg,用蒸餾水溶解并定容至100 mL,配得對羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為0.25 mg/mL。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL于25 mL比色管中,用水定容至10 mL。各加入1.0 mL稀釋兩倍的Folin-酚試劑和20%碳酸鈉溶液2.0 mL,充分混勻,沸水浴加熱1 min,冷水冷卻并稀釋至25 mL。室溫放置30 min,于745 nm波長測定吸光度。以對羥基苯甲酸濃度為橫坐標(biāo),吸光度作為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=0.0672+0.0011x(R2=0.9980)。各取一定體積的樣品上清液,按上述方法操作進(jìn)行總酚含量測定。每個樣品平行測定3次。

1.2.4 總黃酮含量測定 參考方芳[15]方法并稍作調(diào)整。稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品7.5 mg,加入無水乙醇溶解并定容至50 mL,配成標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.50、2.00、3.00、4.00 mL至10 mL刻度比色管中,加30%乙醇溶液至5 mL,加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,振搖后放置5 min,加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻后放置6 min,加入1.0 mol/L NaOH溶液4 mL,30%乙醇溶液定容至10 mL,靜置10 min。以零管為空白,在510 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=0.03986+0.0006x(R2=0.9983)。各取1 mL待測樣品上清液(稀釋到工作曲線線性范圍內(nèi)),加入10 mL刻度比色管中,同上操作。每個樣品平行測定3次。

1.2.5 清除DPPH自由基能力的測定 參照Brand-Williams等[16]建立的方法并稍作調(diào)整,準(zhǔn)確配制濃度為1×10-4mol/L的DPPH溶液。移取上述籽粒莧籽實提取液0.2 mL,DPPH溶液3.8 mL,混勻,以0.2 mL 50%乙醇與DPPH反應(yīng)液為空白。避光反應(yīng)1 h,517 nm測定吸光度。各樣品濃度為33.33 mg/mL時,計算DPPH自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100,其中A1為測試液吸光度,A0為空白對照組的吸光度。

1.2.6 清除ABTS+自由基能力的測定 參照Re等[17]建立的方法并稍作調(diào)整,將7 mmol/L的ABTS溶液和140 mmol/L的過硫酸鉀溶液,以500∶88比例混合,避光靜置12～16 h,形成墨綠色穩(wěn)定化合物,作為儲備液。將儲備液用乙醇稀釋至734 nm吸光度0.70±0.02。移取上述提取液0.1 mL,加入ABTS+儲備液3.9 mL,混勻后,避光靜置6 min,測試734 nm波長吸光度A1。以0.1 mL 50%乙醇和3.9 mL ABTS+工作液吸光度為空白對照A0。因此,當(dāng)樣品濃度33.33 mg/mL時,測得ABTS+自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100。

1.2.7 鐵離子還原能力測定 參考Benzie等[18]建立的方法并稍作調(diào)整,以10∶1∶1混合0.3 mol/L(pH3.6)的醋酸緩沖溶液,10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L氯化鐵溶液,即得FRAP工作液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL系列濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液,與0.3 mL去離子水混合,再加入3.9 mL FRAP溶液,混勻,37 ℃反應(yīng)4 min。于593 nm測吸光度,繪制硫酸亞鐵-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確吸取0.1 mL上述樣品提取液,與0.3 mL去離子水混合,再加入3.9 mL FRAP溶液,混勻,37 ℃反應(yīng)4 min,593 nm測吸光度。以硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)的FeSO4濃度,定義為當(dāng)量濃度(FRAP值)。最終結(jié)果表示為每克樣品中相當(dāng)于FeSO4的量(mmol FeSO4/L/g樣品)。FRAP值越大,表示抗氧化活性越強。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計分析軟件包,所有實驗均重復(fù)測定3次,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示,并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行多組之間均數(shù)的差異性檢驗,p<0.05認(rèn)為具有顯著性差異,相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實總酚和總黃酮含量的影響

圖1a、1b分別表示蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實總酚和總黃酮含量的影響。采用Folin-酚法測定樣品的總酚含量,未汽爆組所測總酚含量為(1.459±0.140) mg/g干物質(zhì)(以對羥基苯甲酸計),略低于文獻(xiàn)報道[19]。

從圖1a中可以看出,當(dāng)汽爆壓力0.3 MPa時,隨著時間延長,總酚含量不斷增加,在120 s時達(dá)到最高值4.500 mg/g,是未汽爆樣品總酚含量的3.1倍。當(dāng)汽爆壓力達(dá)到0.6 MPa時,總酚含量顯著增加(p<0.05),在60 s時達(dá)到7.798 mg/g,此時,總酚含量在所有處理條件下達(dá)到最高,是未汽爆樣品的5.3倍;當(dāng)時間延長一倍時(120 s),總酚含量反而出現(xiàn)下降,為7.221 mg/g。繼續(xù)增大汽爆壓力,在0.9和1.2 MPa兩種壓力條件下,樣品總酚含量呈現(xiàn)與低壓條件下不同的變化趨勢。當(dāng)汽爆時間低于20 s時,兩壓力條件下的總酚含量均明顯高于未汽爆組和低壓力組(0.3 MPa,p<0.05);當(dāng)時間增加,總酚含量均呈現(xiàn)下降趨勢,在1.2 MPa、120 s時達(dá)到最低值,為1.559 mg/g,略高于未汽爆組。當(dāng)汽爆壓力持續(xù)增大至1.5 MPa,0～60 s時總酚含量僅略高于未汽爆組,120 s甚至低于未汽爆組。因此,在0.6 MPa、60 s的汽爆條件下,籽粒莧籽實總酚含量達(dá)到最高值。

圖1 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實總酚和總黃酮含量的影響

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定樣品的總黃酮含量,未汽爆組測得總黃酮含量為(0.629±0.170) mg/g干物質(zhì)(以蘆丁計)。從圖1b中可以看出,不同汽爆壓力條件下,隨著時間延長,總黃酮含量同總酚含量變化趨勢類似,在0.6 MPa、120 s時總黃酮含量達(dá)到最高值,為4.618 mg/g,是未汽爆樣品的7.3倍。

低處理強度下,總酚含量隨處理時間延長而增加;而在高處理強度下,總酚含量反而下降。該實驗趨勢與Gong[8]、劉翀[12]、趙夢麗[13]、張瑞婷[20]等研究基本一致。張瑞婷[20]研究汽爆處理對麥麩總酚的影響,在2.5 MPa、30 s時,總酚含量最高,達(dá)到了28 mg/g,約是未處理組的9倍。進(jìn)一步增加處理條件,總酚含量下降。一般認(rèn)為,谷物中的大部分酚類物質(zhì)都是與蛋白質(zhì)、糖類、纖維素等大分子結(jié)合,不易提取[21]。原料在蒸汽爆破過程中,物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分會發(fā)生較大變化,存在著類似酸水解、熱降解、類機械斷裂、氫鍵斷裂和結(jié)構(gòu)重排等協(xié)同作用[11]。這些物理和化學(xué)作用促使谷物中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素發(fā)生不同程度的降解,此時,與之結(jié)合的酚類物質(zhì)得到大量釋放,因此在較低汽爆壓力下,總酚含量隨著時間延長而不斷提高。但是,酚類物質(zhì)并不能隨著汽爆條件的提高而無限增加,在0.9、1.2 MPa壓力下,總酚含量呈現(xiàn)明顯的先升后降的變化趨勢,在1.5 MPa時,總酚含量非常低,始終接近甚至低于未汽爆樣品。究其原因,高溫可能會造成酚類物質(zhì)的分解[22],過高強度的汽爆處理會造成酚類物質(zhì)的損失。

此外,觀察汽爆處理后的樣品性狀,圖2是汽爆壓力0.6 MPa時,不同汽爆時間的籽粒莧籽實圖片。發(fā)現(xiàn)隨著時間延長,籽實顏色逐漸加深,破碎顆粒數(shù)有所增加,伴隨糊化現(xiàn)象;圖3是汽爆時間60 s時,不同壓力的籽粒莧籽實圖片,發(fā)現(xiàn)在1.2、1.5 MPa下,大部分籽實破碎,糊化嚴(yán)重,出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象,有焦糊氣味。由此可知,高強度或長時間汽爆處理可能會伴隨不同程度的美拉德反應(yīng),極有可能造成酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)的損失。因此,1.5 MPa處理強度過大,已不適合籽粒莧籽實樣品,可以棄去。

圖2 不同汽爆時間的籽粒莧籽實的拍照圖片

圖3 不同汽爆壓力的籽粒莧籽實的拍照圖片

2.2 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實抗氧化能力的影響

2.2.1 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實清除DPPH自由基能力的影響 DPPH自帶單電子,非常穩(wěn)定,其乙醇溶液在517 nm有強吸收,呈紫色。當(dāng)存在自由基清除劑時,可與DPPH單電子配對而導(dǎo)致吸收減弱,顏色減弱程度與自由基清除能力呈正相關(guān),可用于衡量研究對象的抗氧化能力。

如圖4所示,與未汽爆樣品DPPH自由基清除率(16.81%±1.15%)相比,經(jīng)過0.3、0.6 MPa蒸汽爆破處理后,籽粒莧籽實清除DPPH自由基的能力顯著提高(p<0.05)。0.3 MPa、120 s條件下,DPPH自由基清除率達(dá)到該壓力條件下的最大值,為33.62%±1.94%,是未汽爆樣品的2.0倍。繼續(xù)升高汽爆壓力,增至0.6 MPa,隨著汽爆時間延長,DPPH自由基清除率在60 s、120 s時分別達(dá)到76.62%±2.98%和75.65%±0.77%,依次是未汽爆樣品的4.6倍和4.5倍?？芍瑝毫?.6 MPa、汽爆時間60 s時,樣品對DPPH自由基清除率最高。繼續(xù)增大汽爆強度,從圖4中可知,0.9、1.2 MPa條件下,DPPH自由基清除率先提高再陡然降低;而在1.5 MPa時,DPPH自由基清除率在不同的時間段均低于未汽爆組,即最高強度的汽爆處理反而造成DPPH自由基清除效果大大降低。張瑞婷[20]研究發(fā)現(xiàn)汽爆條件1.5 MPa、90 s時,麥麩提取液有最高的清除DPPH自由基水平,繼續(xù)增加壓力和時間,反而呈略微下降趨勢,與本研究結(jié)果類似?？赏茰y,蒸汽爆破處理對于籽粒莧籽實抗氧化成分如酚類物質(zhì)的釋放是有限的,當(dāng)達(dá)到一定強度后,樣品清除DPPH自由基效果不再明顯;而更高強度蒸汽爆破處理有可能造成抗氧化成分的損失[22],樣品清除DPPH自由基能力降低。

圖4 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實清除DPPH自由基能力的影響

2.2.2 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實清除ABTS+自由基能力的影響 ABTS在氧化劑存在下能生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色化合物ABTS+,ABTS+在734 nm波長有最大吸收,當(dāng)存在抗氧化成分時,能夠減少ABTS+的生成,從而使藍(lán)綠色褪去,通過測定顏色褪去的程度即可衡量樣品的抗氧化能力。

如圖5所示,汽爆處理后ABTS+自由基清除率的變化趨勢同DPPH測定結(jié)果呈現(xiàn)一致性。測定結(jié)果表明,在低汽爆壓力下(0.3、0.6 MPa),蒸汽爆破處理后籽粒莧籽實的抗氧化能力有所提高,在0.6 MPa、60 s時有最強抗氧化效果(p<0.05)。其中,未汽爆樣品的ABTS+自由基清除率為22.93%±1.85%,0.6 MPa、60 s時ABTS+自由基清除率為86.17%±1.08%,后者是前者的3.8倍。Gong[8]測定汽爆處理前后青稞麩皮的ABTS+清除能力,最大增至9.1倍。

圖5 汽爆處理對籽粒莧籽實清除ABTS+自由基能力的影響

2.2.3 蒸汽爆破預(yù)處理對籽粒莧籽實鐵離子還原能力的影響 樣品具有還原能力,可間接認(rèn)為其具有一定的抗氧化能力[23]。在較低pH條件下,赤血鹽K3Fe(CN)6中的三價鐵Fe3+可被還原性成分還原為二價鐵黃血鹽Fe4(Fe(CN)6,Fe2+與三吡啶三吖嗪TPTZ形成藍(lán)色復(fù)合物,在593 nm處有最大吸收,通過測定吸光度的大小計算樣品的還原能力。

如圖6所示,汽爆處理后亞鐵離子還原能力的變化趨勢同DPPH、ABTS+測定結(jié)果一致。結(jié)果表明,在低汽爆壓力下(0.3 MPa),蒸汽爆破處理后籽粒莧籽實的亞鐵離子還原能力隨時間延長而緩慢升高,0.6 MPa汽爆壓力下,亞鐵離子還原能力增幅急劇,在0.6 MPa、60 s時達(dá)到最強還原能力(p<0.05)。其中,未汽爆樣品的亞鐵離子還原能力為(57.50±14.3) mmol FeSO4/L/g,0.6 MPA、60 s時為(667.10±17.84) mmol FeSO4/L/g,后者是前者的11.6倍,該汽爆條件下樣品的亞鐵離子還原能力非常強。Gong[8]測定汽爆處理前后青稞麩皮的亞鐵離子還原能力,220 ℃、120 s獲得最好效果,亞鐵離子還原能力最大增至2.8倍。劉翀[12]發(fā)現(xiàn)在2.5 MPa、30 s的蒸汽爆破條件下,麥麩提取液有最強的亞鐵離子還原能力。張瑞婷[20]通過測定不同汽爆條件下的麥麩樣品鐵離子還原能力的變化,發(fā)現(xiàn)在2.5 MPa、90 s時達(dá)到最大值,繼續(xù)加大處理強度,反而有所下降,與本實驗結(jié)果類似,這表明過高強度的蒸汽爆破處理不利于籽粒莧籽實抗氧化成分的釋放。

圖6 汽爆處理對籽粒莧籽實亞鐵離子還原能力的影響

2.3 籽粒莧籽實抗氧化能力和總酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析

由圖1、圖4、圖5、圖6可觀察到蒸汽爆破處理后樣品的總酚、總黃酮含量與抗氧化能力(DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、鐵離子還原能力)有相似的變化趨勢。因此,本文進(jìn)一步分析了不同汽爆條件下籽粒莧籽實總酚、總黃酮含量與抗氧化能力各指標(biāo)之間的相關(guān)性,結(jié)果如表1所示。DPPH自由基清除率與總酚、總黃酮含量均具有顯著的正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為r=0.9343,p<0.05;r=0.9773,p<0.05。此外,不同汽爆條件下籽粒莧籽實清除ABTS+自由基的能力與總酚、總黃酮含量兩兩之間也呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性,r=0.9376,p<0.05;r=0.9786,p<0.05。進(jìn)一步分析了不同汽爆條件下籽粒莧籽實總酚、總黃酮含量與鐵離子還原能力的關(guān)系,均表明具有顯著的正相關(guān)性(r=0.9384,p<0.05;r=0.9111,p<0.05)。從以上相關(guān)性分析可知,籽粒莧籽實的抗氧化能力與其總酚、總黃酮含量密切相關(guān),抗氧化能力的大小取決于總酚、總黃酮含量的高低,與Gong[8]、孫丹[21]、袁佐云[24]等結(jié)論一致。

表1 不同汽爆條件的籽粒莧籽實抗氧化能力與總酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

在一定處理條件下,蒸汽爆破處理有助于籽粒莧籽實酚類、黃酮類物質(zhì)的提取,抗氧化能力增強。低處理強度(0.3、0.6 MPa)利于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解,結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)大量釋放,在0.6 MPa、60 s時達(dá)到最佳條件,此時總酚、總黃酮含量分別為未汽爆組的5.3倍和7.3倍,差異顯著(p<0.05)。較高強度的處理條件(0.9、1.2 MPa)不利于酚類、黃酮類物質(zhì)的提取,更高強度時(1.5 MPa)甚至低于未汽爆組,在于過高強度的蒸汽爆破處理可能會造成酚類物質(zhì)的分解。

籽粒莧籽實經(jīng)蒸汽爆破處理后抗氧化能力明顯增強,在0.6 MPa、60 s時,清除DPPH、ABTS+自由基能力、鐵離子還原能力分別是未汽爆組的4.6、3.8和11.6倍?？寡趸芰Φ脑鰪娕c總酚、總黃酮含量的增加密切相關(guān),分析顯示,各抗氧化指標(biāo)與總酚、總黃酮含量均有顯著的正相關(guān)性。

蒸汽爆破過程無化學(xué)試劑添加,對環(huán)境友好,且處理后能大大提高籽粒莧籽實活性成分的含量和抗氧化能力,效果明顯,可為籽粒莧籽實的后續(xù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。