王 婧,周 威,胡梁斌,鐘 敏,張 浩

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

肉桂醛作為天然醛類化合物來(lái)源于肉桂等多種植物中,能有效抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)[1-3]。近年來(lái),相關(guān)報(bào)道指出,肉桂醛能顯著抑制或清除多種微生物形成的生物膜[4-6]。肉桂醛的許多衍生物也具有良好的抑菌活性。課題組通過(guò)前期篩選和比較對(duì)肉桂醛及其多種衍生物進(jìn)行了抑菌活性比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對(duì)肉桂醛及其7種衍生物如肉桂酸、肉桂醇、苯丙醛、苯丙酸、苯丙醇、氯代肉桂醛、甲基肉桂醛等開展的抑菌實(shí)驗(yàn)中,氯代肉桂醛的抑菌活性最高,其對(duì)食源性病原微生物如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌均具有良好的抑制效果。

氯代肉桂醛作為肉桂醛的衍生物,在物理性質(zhì)上為油狀液體,雖具有良好的抗菌活性,但其與水不相溶、具刺激氣味和高度揮發(fā)等特性會(huì)限制其在實(shí)際工作中的應(yīng)用。大量研究表明將精油納米化是有效解決這一問(wèn)題的方法之一。納米乳是各向同性,熱力學(xué)穩(wěn)定的透明(或半透明)液體。形成納米乳的方法有高能量法與低能量法,低能量法中的自發(fā)乳化法,通過(guò)混合助劑材料自發(fā)形成納米乳。納米乳的粒徑可通過(guò)改變組分含量和改變環(huán)境因素[7]等條件進(jìn)行調(diào)整,此體系中含有油、水、表面活性劑等化合物,粒徑在10～100 nm,因而具有長(zhǎng)期的穩(wěn)定性,能高度溶解精油類等水難溶性的物質(zhì),使其成為攜載藥物的有效工具之一[8],且能克服精油在水相體系中時(shí),物理和化學(xué)性質(zhì)都不穩(wěn)定的現(xiàn)象[9]。納米化技術(shù)不但解決了精油利用受限的問(wèn)題,且許多實(shí)驗(yàn)表明納米化后精油的活性也被顯著提高。其中,王德德等[10-11]研究的納米化肉桂醛具有抗辣椒疫霉病原菌與抗黃曲霉菌的增效作用等。因此,對(duì)氯代肉桂醛開展的深入研究,能為研發(fā)環(huán)境消殺劑及食品器械接觸用滅菌劑提供理論依據(jù),且能為擴(kuò)大其利用范圍開發(fā)新類型的藥物制劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌MG1655 購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種管理保藏中心;沙門氏菌CVCC541 由河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院提供;氯代肉桂醛 美國(guó)Sigma公司;吐溫-80 北京索萊寶科技有限公司;橄欖油 100%,上海市浦東新區(qū),食品級(jí);無(wú)水乙醇 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;試劑均為分析純。

ZetasizerNano V 7.11型激光粒度分析儀 英國(guó)Marlvern instrument公司;透射電子顯微鏡 日本奧林巴斯公司;多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾公司;UV-7200型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯公司;SHP-160 型智能恒溫培養(yǎng)箱 上海滬循科學(xué)儀器公司;HL-2S型恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;78-1型磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米化氯代肉桂醛制備

1.2.1.1 油相篩選 由于氯代肉桂醛難溶于水,可選擇有機(jī)溶劑來(lái)溶解。將10 μL氯代肉桂醛精油分別滴在5 mL橄欖油、維生素E油與乙酸乙酯中,邊滴邊振蕩,直至飽和狀態(tài),記錄滴加體積,氯代肉桂醛在三者中選取溶解度最大的作為油相[12]。

1.2.1.2 表面活性劑篩選 參考Azeem[13]的方法,取非離子表面活性劑Tween-80、EL-40,將表面活性劑與超純水以3∶20 (w/w)比例混合,37 ℃水浴10 min,渦旋振蕩,充分混勻,若液體澄清,再次加入10 μL 氯代肉桂醛,直至液體渾濁為止。溶解油相最多的表面活性劑為最佳表面活性劑。

1.2.1.3 助表面活性劑篩選 經(jīng)過(guò)初步篩選,選擇無(wú)水乙醇、1,2-丙二醇及混合醇(乙醇∶1,2-丙二醇=13∶12)作為助表面活性劑,室溫下,將吐溫-80與三種助表面活性劑按質(zhì)量比為3∶1的比例混合,然后與確定的油相按照質(zhì)量比(w/w)為9.8∶0.2、9.5∶0.5、9∶1、8.75∶1.25、8.5∶1.5、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例混合,室溫下,用恒流泵逐滴加入蒸餾水,邊滴加邊用磁力攪拌器攪拌,記錄體系由澄清到混濁時(shí)的各組分的質(zhì)量百分比并記錄用水量,以水相、油相、表面活性劑作為三個(gè)頂點(diǎn),利用Origin 8.0繪制偽三元相圖,根據(jù)乳區(qū)大小,篩選最佳的助表面活性劑。

1.2.1.4 Km值確定 表面活性劑和助表面活性劑的質(zhì)量比例為Km值[14],室溫下將篩選好的表面活性劑和助表面活性劑按照質(zhì)量比為4∶1、5∶1、6∶1混合好,然后此混合物同油相以9.8∶0.2、9.5∶0.5、9∶1、8.75∶1.25、8.5∶1.5、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例混合,室溫下,用恒流泵逐滴加入蒸餾水,邊滴加邊用磁力攪拌器攪拌,記錄體系由澄清到混濁時(shí)的各組分的質(zhì)量百分比并記錄用水量,以水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑作為三個(gè)頂點(diǎn)利用Origin 8.0繪制偽三元相圖,根據(jù)乳區(qū)的大小,篩選最佳的Km值[15]。

1.2.2 納米化氯代肉桂醛的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.2.2.1 納米化氯代肉桂醛結(jié)構(gòu)類型的鑒別 取兩份等體積的氯代肉桂醛納米乳,一份滴入油溶性蘇丹Ⅲ,另一份滴入水溶性亞甲基藍(lán),記錄兩份樣品在5 s、1 min與5 min時(shí)染料在納米乳中的擴(kuò)散狀況和體系的外觀變化,若制備的納米乳為水包油型(oil in water,O/W),則亞甲基藍(lán)在樣品中的擴(kuò)散速度快于蘇丹Ⅲ,且亞甲基藍(lán)會(huì)溶于納米乳體系,蘇丹Ⅲ則不溶[16]。

1.2.2.2 納米化氯代肉桂醛的粒徑分析 取制備好的納米化氯代肉桂醛,用去離子水稀釋100倍,旋渦振蕩儀混勻后用0.22 μm的水系濾膜過(guò)濾,分成兩份,其中一份,吸取少量的樣品液滴加在含有Formvar膜的銅網(wǎng)上,用磷鎢酸負(fù)染30 s,放在通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干,在透射電鏡下觀察納米乳的形態(tài)[17];另一份則借助激光粒度分析儀檢測(cè)其平均粒徑和多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI),PDI值越高,納米乳粒徑的均一性越差,PDI<0.7視為穩(wěn)定[18]。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)三組重復(fù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 納米化氯代肉桂醛熱力學(xué)穩(wěn)定性評(píng)估

1.2.3.1 冷熱儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 在4 ℃和40 ℃兩種環(huán)境下,循環(huán)交替存放24 h,連續(xù)5次循環(huán),看是否出現(xiàn)相的分離、渾濁、乳狀液分層和破乳等現(xiàn)象。

1.2.3.2 高速離心實(shí)驗(yàn) 將剛制備好的納米乳放在2 mL離心管中,10000 r/min離心30 min,觀察外觀是否出現(xiàn)分層、渾濁和絮凝等不穩(wěn)定的現(xiàn)象[8],在由水、油、表面活性劑和助表面活性劑形成的分散體系中,在100倍重力下,不發(fā)生相的分離,即可認(rèn)為此納米乳穩(wěn)定[19]。

1.2.3.3 凍融循環(huán)實(shí)驗(yàn) 取三組制備好的納米乳在-20 ℃和20 ℃的環(huán)境下,經(jīng)過(guò)三次凍融循環(huán),每個(gè)環(huán)境下存放48 h,觀察納米乳的形態(tài)。

1.3 納米化氯代肉桂醛的溶血實(shí)驗(yàn)

采用96微孔,每孔加入195 μL制備好的2%兔血紅細(xì)胞懸液,用氯代肉桂醛精油和納米化氯代肉桂醛處理,使其終濃度為0、50、100、200、300、400、500、800、1000 μg/mL,2% triton處理作為陽(yáng)性對(duì)照;溶劑作為陰性對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h,取出放在離心機(jī)中離心15 min,觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

1.4 納米化氯代肉桂醛的抑菌活性

1.4.1 最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)

取-80 ℃的菌種劃線培養(yǎng),挑取單克隆,接種到液體培養(yǎng)基中37 ℃過(guò)夜搖培,以1∶200的比例轉(zhuǎn)接至OD600=0.8～1.0,稀釋此溶液至OD600≈0.1,再稀釋100倍,作為測(cè)MIC、MBC的待測(cè)菌液。

MIC值:用微量滴定法,在96孔板中每孔加入200 μL菌懸液,依次加入氯代肉桂醛和納米化氯代肉桂醛,使其終濃度分別為20、40、80、100、200、300、400、500、600 μg/mL,37 ℃培養(yǎng)24 h,目測(cè)法檢查細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度被定為MIC值[20],同時(shí)用酶標(biāo)儀測(cè)定其在OD600值,以吸光度的變化得出它們的抑菌活性。

MBC值:依據(jù)最小抑菌濃度(MIC)的結(jié)果,取OD=0.1稀釋100倍的菌液,6000 r/min,離心3 min棄上清,加1 mL PBS懸起,梯度稀釋作為對(duì)照。在96孔板中,用納米化和非納米化的Cl-CA的終濃度分別為15、30、37.5、75、150 μg/mL的處理,37 ℃培養(yǎng)24 h。分別從每孔中吸取10 μL培養(yǎng)物，采用梯度稀釋滴板法[21]測(cè)定菌落總數(shù),以菌落存活率下降3lg的最低抑菌濃度為MBC值[22]。吸取每個(gè)梯度的稀釋液10 μL滴LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)菌落生長(zhǎng)數(shù)目。

1.4.2 納米化氯代肉桂醛對(duì)生物膜的清除作用 利用生物膜能被結(jié)晶紫著色固定的原理[23],選擇金黃色葡萄球菌S.aureusATCC25923、大腸桿菌E.coilMG1655、沙門氏菌S.enteriditisCVCC541來(lái)研究納米化氯代肉桂醛對(duì)微生物已經(jīng)形成的生物膜的清除作用。96孔板中,每孔加入107cfu/mL的菌液,190 μL液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h形成生物膜。將上層的培養(yǎng)基吸掉,然后用PBS進(jìn)行沖洗,避免把生物膜沖破,吸走PBS清洗液,放置在4 ℃過(guò)夜干燥,在每個(gè)孔里加入200 μL納米化的氯代肉桂醛,使其終濃度為0、93.75、187.5、375、750、1500 μg/mL,37 ℃培養(yǎng)24 h。藥物處理過(guò)后,將藥物移除,每個(gè)孔里加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫溶液處理5 min,充分固定生物膜。著色后,用相同倍數(shù)的蒸餾水清洗2～3次以清除未被吸收的結(jié)晶紫,在37 ℃的氣流中進(jìn)行干燥。加入200μL乙醇溶解結(jié)晶紫,并用酶標(biāo)儀測(cè)定其在595 nm下的吸光值[24],利用吸光值大小的變化來(lái)確定生物膜的清除效果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本研究中所有實(shí)驗(yàn)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。用SPSS 11軟件one-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析同時(shí)利用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢測(cè)(p<0.05)。Orgin 8.0進(jìn)行繪圖,其中各圖同一指標(biāo)中不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米乳配方的篩選及制備

2.1.1 油相篩選 親脂性的藥物傾向于溶解在O/W類型的納米乳中,藥物裝載在油相中和其他組分形成納米乳,疏水性藥物在油相中的溶解度越大則形成納米乳的油相體積越小,在實(shí)際應(yīng)用中就越易進(jìn)行藥物遞送。油相作為納米乳重要的成分之一,Azeem曾指出蓖麻油、玉米油、椰子油、礦物油、乙酸乙酯等均可作為油相形成納米乳[25]。在備選油相中,氯代肉桂醛在橄欖油中的溶解度最大,且橄欖油來(lái)源天然、穩(wěn)定性好、無(wú)毒無(wú)害符合納米乳制備中油相的選擇標(biāo)準(zhǔn),故作為油相。

2.1.2 表面活性劑篩選 表面活性劑的選擇決定形成納米乳的穩(wěn)定性,在表面活性劑的選擇中最關(guān)鍵的因素是化合物的毒性。相對(duì)離子型表面活性劑來(lái)說(shuō),非離子表面活性劑的毒性相對(duì)較小且臨界膠離子濃度較小[11]。非離子表面活性劑很少因體系的pH和離子強(qiáng)度的改變而受影響,且體系具有良好的流動(dòng)性[13]，經(jīng)常被認(rèn)為是安全和生物適用,在此體系中吐溫-80能溶解更多的氯代肉桂醛,故選擇作為表面活性劑。

2.1.3 助表面活性劑篩選 納米乳體系中加入助表面活性劑首先是為了降低表面活性劑的使用濃度，減小界面張力和增加界面的流動(dòng)性,其次其能增加表面活性劑烴鏈尾部的流動(dòng)性,滲透更多的油相到該烴鏈區(qū)域,助表面活性劑一般選擇短鏈或中鏈醇類,醇類具有增加水相和油相相互滲透的作用且能相互包容[26]。由圖1可比較出橄欖油-水-吐溫-80和不同的助表面活性劑,形成乳區(qū)面積的大小,在此體系中無(wú)水乙醇和1,2-丙二醇作為混合助表面活性劑的成乳區(qū)最大,因此選擇混合醇類作為助表面活性劑。

圖1 不同助表面活性劑形成納米乳區(qū)面積的對(duì)比

2.1.4 Km值的確定 利用偽三元相圖成乳區(qū)面積的大小對(duì)納米乳的Km值進(jìn)行篩選,Km的篩選是為了進(jìn)一步優(yōu)化納米乳的配方,使得各組分不分先后順序加在一起都能形成穩(wěn)定的納米乳。研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑:助表面活性劑的Km比值不但影響相圖中成乳區(qū)面積和位置的關(guān)鍵因素[13],還能通過(guò)增加分散熵、增加界面區(qū)域來(lái)降低納米乳體系的自由能以至于使用低劑量的助劑濃度達(dá)到體系熱力學(xué)穩(wěn)定的目標(biāo)。通過(guò)圖2顯示,同其他比值相比,當(dāng)Km=4∶1(吐溫-80∶混合醇)時(shí)偽三元相圖形成的乳區(qū)面積最大,表明在此條件下形成納米乳體系更加穩(wěn)定,因此選擇Km=4∶1。

圖2 不同Km值納米乳區(qū)面積的對(duì)比

故納米乳的制備方法為:將w(氯代肉桂醛)=2.81%加入w(橄欖油)=1.02%中混合均勻,逐滴滴加w(吐溫-80)=25%,w(無(wú)水乙醇)=3.26%,w(1,2-丙二醇)=2.99%,最后逐滴加入w(蒸餾水)=65.3%,邊滴加邊攪拌,直至形成澄清透明的納米乳。

2.2 納米化氯代肉桂醛的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 納米化氯代肉桂醛的結(jié)構(gòu)類型鑒別 圖3A中可以看出,制備好的納米化氯代肉桂醛是微淡黃色澄清透明液體,具有良好的流動(dòng)性,把水溶性的染料亞甲基藍(lán)和油溶性的染料蘇丹Ⅲ同時(shí)滴入剛制備氯代肉桂醛納米乳中,滴入5 s(圖3a)、滴入1 min(圖3b)、滴入5 min(圖3c)后呈現(xiàn)出不同景象。從圖3a、b、c中可看出亞甲基藍(lán)滴入5 s即可融入氯代肉桂醛納米乳中,5 min后和納米乳相容;而蘇丹Ⅲ圖3d、e、f滴入后不能溶于納米乳中,分層明顯,由此可以證明制備的氯代肉桂醛納米乳為O/W類型的納米乳。

圖3 兩種染料在氯代肉桂醛納米乳中的擴(kuò)散過(guò)程

2.2.2 納米化氯代肉桂醛形態(tài)觀察及粒徑分析 在12000倍的透射電鏡下觀察到氯代肉桂醛納米乳,乳滴呈現(xiàn)規(guī)則的球形,形態(tài)大小較一致,液滴平均粒徑為25.35 nm,分散性良好,無(wú)破乳團(tuán)聚等現(xiàn)象(圖4a)。

圖4 納米乳的透射電鏡和粒度分布圖片

激光粒度分析儀的結(jié)果顯示,其平均粒徑為(15.88±1.01) nm,PDI為0.16,PDI系數(shù)越小表明形成的納米乳粒徑的均一性越好,粒徑分布范圍均在10～50 nm(圖4b)。

2.2.3 納米化氯代肉桂醛的穩(wěn)定性分析 為防止形成的納米乳是亞穩(wěn)定的狀態(tài),可通過(guò)熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行冷熱交替儲(chǔ)藏、高速離心、反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其熱力學(xué)穩(wěn)定性,經(jīng)過(guò)上面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)制備的氯代肉桂醛納米乳外觀仍為微淡黃色澄清透明的液體,在10000 r/min離心30 min后未出現(xiàn)相的分離、渾濁、乳狀液分層和破乳等不穩(wěn)定現(xiàn)象,在4 ℃和40 ℃交替存放24 h,取出并未發(fā)現(xiàn)相的分層和沉淀等現(xiàn)象,故此體系為熱力學(xué)穩(wěn)定的體系,且通過(guò)透射電鏡及激光粒度分析儀的測(cè)定,粒徑未發(fā)生變化。

2.3 氯代肉桂醛納米乳的生物安全性

從圖6中可以看出,作為陰性對(duì)照的溶劑不會(huì)對(duì)紅細(xì)胞造成破壞,而2% triton作為陽(yáng)性對(duì)照能完全引起血紅細(xì)胞的破裂;因此和氯代肉桂醛精油相比,納米化氯代肉桂醛在濃度為300 μg/mL時(shí),引起紅細(xì)胞的破裂,但氯代肉桂醛在100 μg/mL即引發(fā)溶血現(xiàn)象,由此可見(jiàn)納米化修飾后能顯著提高氯代肉桂醛的生物安全性。

圖5 氯代肉桂醛和納米化氯代肉桂醛處理2%血紅細(xì)胞的溶血現(xiàn)象對(duì)比

圖6 納米化氯代肉桂醛對(duì)三種細(xì)菌生物膜的清除作用

2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

通過(guò)對(duì)比納米化氯代肉桂醛和氯代肉桂醛的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)納米化后能增大氯代肉桂醛的抑菌作用,結(jié)果見(jiàn)表1,體外抑菌實(shí)驗(yàn)顯示抑菌活性均提高了50%～200%,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有良好的抑菌作用,這與李紅波等發(fā)現(xiàn)將肉桂醛納米化后能夠顯著的提高其抑菌活性的結(jié)果相一致[11]。

表1 氯代肉桂醛和納米化氯代肉桂醛對(duì)8種細(xì)菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.5 納米化氯代肉桂醛對(duì)生物膜的清除作用

通過(guò)測(cè)定OD595 nm的吸光值來(lái)分析納米化氯代肉桂醛是否能清除或裂解已經(jīng)形成的細(xì)菌生物膜,在此選擇靜置培養(yǎng)48 h的生物膜來(lái)分析。由于培養(yǎng)72 h時(shí),其生物膜量低于前期(24～48 h),可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的匱乏引起了自行裂解。在培養(yǎng)48 h的A:S.aureusATCC25923、B:E.coilMG1655、C:S.EnteriditisCVCC541三種細(xì)菌的上層LB液體培養(yǎng)基中,未發(fā)現(xiàn)生物膜裂解的殘留,進(jìn)而在48 h形成的生物膜中加入濃度為93.75～1500 μg/mL的納米化氯代肉桂醛處理24 h后,測(cè)其OD595 nm下的吸光值,如圖6所示,隨著納米化氯代肉桂醛濃度的升高,OD值逐漸減小,說(shuō)明能清除已形成的生物膜。

3 結(jié)論

本研究以肉桂醛的衍生物氯代肉桂醛作為研究對(duì)象,雖然其抑菌活性比肉桂醛好,但與肉桂醛一樣屬于水不溶性油狀液體且具有揮發(fā)性,導(dǎo)致其在實(shí)際應(yīng)用中受到限制,故采用低能乳化法將其進(jìn)行納米化修飾,納米化后形成了具有良好流動(dòng)性的澄清透明液體,能與水無(wú)限混溶。與非納米化氯代肉桂醛相比,其抑制食源性細(xì)菌活性提高了50%～200%,且能有效清除微生物形成的生物膜。與此同時(shí),納米化修飾后的氯代肉桂醛降低了氯代肉桂醛的溶血濃度,提高了其生物安全性,為氯代肉桂醛在實(shí)際生活中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。