譚曉妍,孫君社,寧慧娟,裴海生,曾文慧,胡 靜,張秀清,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.北京農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院,北京 100125)

中國擁有世界上最豐富的茶葉資源和龐大的茶葉消費(fèi)市場(chǎng),并且隨著我國茶葉消費(fèi)量的逐年增加以及茶葉產(chǎn)業(yè)初、深加工技術(shù)的不斷發(fā)展,不可避免地產(chǎn)生大量茶渣[1-2],不僅造成資源的巨大浪費(fèi),也會(huì)對(duì)環(huán)境造成極大的污染,茶渣的處理成了一個(gè)急需解決的問題[3]。研究表明,茶渣中的蛋白質(zhì)不僅具有營養(yǎng)保健作用,還具有清除體內(nèi)超氧陰離子、降血脂、抗突變、預(yù)防心血管疾病和癌癥的功效[4-6]。但茶渣蛋白基本為水不溶性蛋白,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、提取較為困難。因此通過有效途徑提取茶渣蛋白,提高茶渣蛋白提取率,從而提高茶葉的經(jīng)濟(jì)附加值以及實(shí)現(xiàn)茶渣副產(chǎn)物資源的綜合利用具有重要意義[7]。

目前,茶渣蛋白提取方法多采用NaOH浸提法,同時(shí)輔以超聲、微波及蛋白酶等復(fù)合提取[8-10]。但NaOH具有強(qiáng)腐蝕性,且該法存在提取率低、所得蛋白水溶性不強(qiáng)等缺點(diǎn)[11]。堿性電解水是電解水制備過程中陰極生成的含有NaOH等物質(zhì)的堿性水,一直被作為電解水制備過程中的副產(chǎn)物,目前的相關(guān)研究較少。與傳統(tǒng)的NaOH水溶液相比,強(qiáng)堿性電解水在制備過程中氧化還原電位(ORP)值可達(dá)-1000 mV以下,具有強(qiáng)還原性,可以防止鐵水管中產(chǎn)生赤鐵銹,使水的表面張力降低,從而提高水的洗滌能力。且其含有的活性成分性質(zhì)不穩(wěn)定,易逐漸恢復(fù)為普通水,因而不易對(duì)環(huán)境造成污染,較NaOH使用安全可靠。同時(shí),電解水制取裝置結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單,僅需一個(gè)有隔膜的電解槽,在制取過程中無需大量的化學(xué)原料以及復(fù)雜的單元操作,與生產(chǎn)傳統(tǒng)化學(xué)試劑相比成本低廉,有利于其在食品加工等各項(xiàng)事業(yè)中推廣應(yīng)用[12-14]。

本研究選用堿性電解水用于茶渣蛋白的提取,利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)堿性電解水pH、提取溫度、液固比、提取時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,確定各因素最佳水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化堿性電解水提取茶渣蛋白的最佳工藝。研究進(jìn)一步添加堿性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合提取,有效提高蛋白質(zhì)提取率,并優(yōu)化了蛋白酶水解條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍井綠茶茶渣(粉碎過60目篩) 天津天士力公司;堿性電解水 實(shí)驗(yàn)室自制;堿性蛋白酶(1.0×105U/mL) 上海楷洋生物技術(shù)有限公司;總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

電解槽 為常規(guī)雙槽隔膜式電解槽(自制),隔膜采用陽離子交換膜(異相膜,上?；S),極板為純鈦板(北京中北鈦業(yè)有限公司),極板距離為14 cm;SPD50半自動(dòng)凱氏定氮儀及SPT20紅外高溫消解爐 北京三品科創(chuàng)儀器有限公司;PB-10酸度計(jì) 德國Startorious公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多樣真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;BS200S電子天平 德國Startorious公司;Agilent1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;HH-S數(shù)顯溫控油浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶渣組分分析

1.2.1.1 茶渣中蛋白含量的測(cè)定 采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法,凱氏定氮法,GB5009.5-2010。

1.2.1.2 茶渣中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量測(cè)定 采用美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室的兩步酸性電解水水解法進(jìn)行分析[15]。第一步:準(zhǔn)確稱取干燥后的茶渣樣品0.300 g放入15 mL試管中,加入3.0 mL 72%的硫酸,漩渦混合,將試管放入30 ℃水浴鍋中保持60 min,期間每隔15 min漩渦混合一次。第二步:將試管從水浴鍋中取出,準(zhǔn)確加入去離子水84 mL,將濃硫酸的濃度由72%稀釋至4%,放入高壓滅菌鍋中120 ℃保持1 h。反應(yīng)結(jié)束后,待液體冷卻至室溫,將液體在砂芯漏斗上抽真空進(jìn)行過濾,濾渣烘干稱重即為酸不溶性木質(zhì)素含量,酸溶性木質(zhì)素含量由兩步酸水解的濾液在320 nm下的吸光度測(cè)得。將兩步酸水解的濾液過0.22 μm濾膜,HPLC法測(cè)定其中木糖與葡萄糖含量,由此計(jì)算樣品中纖維素、半纖維素含量。

1.2.1.3 茶渣中水分及干物質(zhì)含量的測(cè)定 采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法,105 ℃恒重法,GB5009.3-2010。

1.2.1.4 茶渣中灰分含量的測(cè)定 采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法,GB5009.4-2010。

1.2.2 堿性電解水的制備 電解電壓:25～35 V;電解電流:0.6 A(定時(shí)監(jiān)測(cè),手動(dòng)調(diào)節(jié)變壓器電壓使其穩(wěn)定在此值);電解質(zhì)濃度:陽極0.1%(NaCl,w/v),陰極1%(NaCl,w/v);定時(shí)測(cè)定陰極室中堿性電解水的pH,達(dá)到所需pH時(shí)即可停止電解,收集電解水,密封保存在4 ℃冰箱備用。

1.2.3 堿性電解水提取茶渣蛋白單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 堿性電解水pH對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 取2 g茶渣于管式反應(yīng)器中,量取40 mL(液固比20∶1 mL/g)pH分別為10、10.5、11、11.5、12、12.5的堿性電解水至管中,振蕩混勻,封上管蓋,放入溫度為120 ℃的油浴鍋中反應(yīng)20 min,檢測(cè)不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.3.2 提取溫度對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 稱取2 g干燥茶渣于管式反應(yīng)器中,量取40 mL(液固比為20∶1 mL/g)pH為12.5的堿性電解水加入管式反應(yīng)器,振蕩混勻,封上管蓋,放入油浴鍋中,處理溫度為90、100、110、120、130 ℃,提取時(shí)間為20 min,檢測(cè)不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.3.3 液固比對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 稱取2 g干燥茶渣于管式反應(yīng)器中,按液固比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g的添加量,加入pH為12.5的堿性電解水至管式反應(yīng)器中,振蕩搖勻,封上管蓋,提取溫度和時(shí)間分別為120 ℃、20 min,檢測(cè)不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 取2 g干燥茶渣于管式反應(yīng)器中,量取80 mL(液固比為40∶1 mL/g)pH12.5的堿性電解水至反應(yīng)器中,振蕩混勻,封上管蓋,放入溫度為120 ℃的油浴鍋中,提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min,檢測(cè)不同條件下茶渣蛋白的提取率。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)確定最佳堿性電解水提取工藝 在單因素優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取合適因素及水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),如表1,以茶渣蛋白提取率為指標(biāo),優(yōu)化預(yù)處理工藝條件,得到最優(yōu)參數(shù)組合。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表

1.2.5 茶渣蛋白初提液蛋白酶酶解條件優(yōu)化 經(jīng)堿性電解水優(yōu)化工藝提取后的茶渣初提液,加入堿性蛋白酶進(jìn)一步提取茶渣蛋白。采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶對(duì)茶渣初提液蛋白提取率的影響。

1.2.5.1 酶解pH對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 鑒于堿性蛋白酶酶活力只在堿性條件下較高,選定不同的酶解pH為7.0、7.5、8、8.5、9、9.5、10(用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)。其他參數(shù)水平保持一致:酶解溫度50 ℃,酶添加量1000 IU/g茶渣,酶解時(shí)間4 h。酶解反應(yīng)在恒溫水浴搖床中進(jìn)行。酶解反應(yīng)結(jié)束時(shí),在100 ℃水浴鍋中保持10 min達(dá)到滅酶的目的。

1.2.5.2 酶解時(shí)間對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 設(shè)定不同酶解時(shí)間分別為2、4、16、32、64 h。其他參數(shù)水平保持一致:酶解溫度50 ℃,酶解pH9,酶添加量1000 IU/g茶渣。酶解反應(yīng)在恒溫水浴搖床中進(jìn)行。酶解反應(yīng)結(jié)束時(shí),在100 ℃水浴鍋中保持10 min達(dá)到滅酶的目的。

1.2.5.3 酶添加量對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 設(shè)定不同的酶添加量:500、1000、1500、2000、2500、3000 IU/g茶渣。其他參數(shù)水平保持一致:酶解溫度50 ℃,酶解pH9.0,酶解時(shí)間32 h。酶解反應(yīng)在恒溫水浴搖床中進(jìn)行。酶解反應(yīng)結(jié)束時(shí),在100 ℃水浴鍋中保持10 min達(dá)到滅酶的目的。

1.2.5.4 酶解液總抗氧化能力測(cè)定 按照總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒說明書檢測(cè)。總抗氧化能力計(jì)算公式如下:

總抗氧化能力(單位/OD樣品)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值/0.01)+30×(反應(yīng)液總量/取樣量)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)

1.2.6 蛋白質(zhì)提取率 蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式如下:

式中,V是處理液總體積,mL;C是鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度,mol/L;6.25是氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù),一般食物為6.25;20是量取的處理液體積,mL;0.014是1.0 mL鹽酸[c(HCl)=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量,g;m是稱取的茶渣質(zhì)量,g;0.27是茶渣中蛋白質(zhì)含量保留兩位小數(shù)時(shí)的數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶渣組分分析

首先對(duì)茶渣主要成分進(jìn)行分析,結(jié)果如表2所示:蛋白質(zhì)含量為27.78%,與其它研究報(bào)道相近,如張曉暉等[16]所報(bào)道的茶葉蛋白含量為25.1%;李娟等[17]報(bào)道了浙江安吉茶廠提供的茶葉加工廢末中蛋白質(zhì)含量為23.21%。由表2可知,茶渣中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量總和為49.05%,木質(zhì)素含量較高,達(dá)到了30.72%。在植物細(xì)胞壁中,木質(zhì)纖維素包裹著蛋白質(zhì),木質(zhì)纖維素的存在限制了蛋白質(zhì)的溶出,如何去除木質(zhì)纖維素是提高茶渣蛋白提取率的有效方法之一[18-19]。已有研究報(bào)道表明，堿性電解水可有效去除生物質(zhì)材料中的木質(zhì)纖維素成分,能提高秸稈的酶解效率[20]。鑒于此,本研究選擇堿性電解水提取茶渣蛋白,以期提高茶渣中堿溶性蛋白的提取率。

表2 茶渣的基本組成成分

2.2 堿性電解水提取茶渣蛋白工藝條件優(yōu)化

2.2.1 電解水pH對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 不同電解水pH下蛋白質(zhì)提取率如圖1。當(dāng)pH在10～11.5之間時(shí),蛋白質(zhì)提取率無明顯變化,均在20%左右;當(dāng)pH>11.5時(shí),隨著pH的增加,茶渣蛋白提取率不斷提高,在pH為12.5時(shí),茶渣蛋白的提取率最高達(dá)到38%。而pH12.5是目前實(shí)驗(yàn)室制備的堿性電解水的極限?？梢?茶渣蛋白在強(qiáng)堿性條件下更易被提取。原因可能是在強(qiáng)堿性電解水中(pH>11.5),木質(zhì)纖維素更易被降解,從而有效提高了茶渣蛋白的溶出率[22]。同時(shí),增強(qiáng)電解水強(qiáng)度也更利于破壞蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵(特別是氫鍵),使部分極性基團(tuán)發(fā)生解離,進(jìn)而增加茶渣蛋白的溶解性[7]。因此隨著堿性電解水的pH升高,茶渣蛋白提取率逐漸升高,但由于pH12.5以上的堿性電解水制備比較困難,綜合考慮,最佳的堿性電解水pH確定為12.5。

圖1 提取pH對(duì)蛋白提取率的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 不同提取溫度下蛋白質(zhì)提取率如圖2。隨著溫度的升高,茶渣蛋白提取率逐漸提高,其原因可能是不同的提取溫度對(duì)茶渣細(xì)胞壁的生物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)破壞力不同,隨著溫度的升高,越來越多的半纖維素、纖維素以及木質(zhì)素結(jié)構(gòu)被破壞以致水解,細(xì)胞壁破裂,使得包裹其中的或細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)等功能性成分被釋放[21],蛋白質(zhì)溶出量增加,從而起到提高茶渣蛋白提取率的作用。由圖2可見,90～120 ℃之間處理時(shí)茶渣蛋白提取率的增長(zhǎng)率高于120～130 ℃,同時(shí)考慮到過高溫度需要更多能耗,且木質(zhì)纖維素等糖類更易與蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)(醛、酮等)[6],綜合考慮后選擇120 ℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對(duì)蛋白提取率的影響

2.2.3 液固比對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 不同液固比下蛋白質(zhì)提取率如圖3。隨著液固比的增大,茶渣蛋白提取率不斷增大,在液固比為40∶1 mL/g時(shí),茶渣蛋白的提取率達(dá)到33%。液固比是影響蛋白質(zhì)提取率的一個(gè)重要因素,堿性電解水的添加量不僅直接影響其與蛋白質(zhì)相互作用的幾率,還影響互相作用的傳質(zhì)及傳熱速度,液固比較低時(shí),雖利于蛋白質(zhì)和堿性電解水的相互接觸,但卻增大了溶液的粘度,影響反應(yīng)過程傳質(zhì)和傳熱,導(dǎo)致茶渣蛋白提取率降低;液固比較高時(shí),可降低反應(yīng)體系的粘度,加快傳質(zhì)傳熱,利于茶渣蛋白浸出[2]。但液固比過高又會(huì)降低蛋白樣品濃度,增加提取難度,造成水資源和能源的浪費(fèi),綜合考慮,最佳預(yù)處理液固比為40∶1 mL/g。

圖3 液固比對(duì)蛋白提取率的影響

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)茶渣蛋白提取率的影響 不同提取時(shí)間下蛋白質(zhì)提取率如圖4。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),茶渣蛋白質(zhì)提取率逐漸升高。從10～30 min時(shí),蛋白質(zhì)提取率增長(zhǎng)較快,30 min后繼續(xù)反應(yīng)蛋白質(zhì)提取率緩慢增長(zhǎng),當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，茶渣蛋白提取率可達(dá)46%。茶渣中含有的粗蛋白80%以上均為谷蛋白[7],反應(yīng)初期這些顆粒外層表面的谷蛋白和醇溶谷蛋白比較容易溶出,提取相對(duì)簡(jiǎn)單。但之后要溶出更多的蛋白質(zhì),溶劑必須進(jìn)入顆粒內(nèi)部,這樣增加了提取的難度,所以時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響不大[2]。由于40 min后蛋白質(zhì)提取率幾乎不再增長(zhǎng),而且考慮到時(shí)間的延長(zhǎng)直接影響著生產(chǎn)周期,會(huì)造成能耗增加。因此初步確定提取時(shí)間為40 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

2.2.5 正交優(yōu)化堿性電解水處理工藝 由單因素實(shí)驗(yàn)可知,堿性電解水的pH、提取溫度、液固比、提取時(shí)間四個(gè)因素對(duì)茶渣蛋白提取率有明顯影響,在此基礎(chǔ)上,對(duì)影響茶渣蛋白提取率的四個(gè)因素選擇合適的水平,進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)一步優(yōu)化,以蛋白提取率為指標(biāo)進(jìn)行極差分析,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表3,方差分析見表4。

表4 方差分析表

由表4可知,提取溫度、液固比對(duì)茶渣蛋白提取率有極顯著作用(p<0.01),堿性電解水的pH對(duì)茶渣蛋白提取率有顯著作用(p<0.05);采用直觀分析法,比較極差分析表3中四因素的極差R值,液固比的極差R值為9.5、提取溫度為3.84、提取時(shí)間為1.33、堿性電解水pH為2.87,由此可知液固比是影響蛋白質(zhì)提取率的最主要因素,影響茶渣蛋白提取率的主次因素從大到小順序依次為:液固比>提取溫度>堿性電解水的pH>提取時(shí)間。根據(jù)極差分析結(jié)果,四因素的最優(yōu)水平組合為A3B1C2D3,結(jié)合方差分析結(jié)果即采用堿性電解水pH為12.5,提取溫度為120 ℃,液固比為40∶1 mL/g,提取時(shí)間為40 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在該最佳提取工藝條件下,得到茶渣蛋白提取率為48.3%。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析表

本研究直接利用堿性電解水提取茶渣蛋白,替代了傳統(tǒng)的堿法提取。堿性電解水提取條件優(yōu)化后,茶渣蛋白提取率最高達(dá)48%,略低于傳統(tǒng)堿法提取的蛋白得率[7,16-17],但也高于部分報(bào)道中的蛋白提取率,如蔡志寧等[23]優(yōu)化了茶渣蛋白堿法提取的工藝條件,優(yōu)化后蛋白提取率為36.8%。經(jīng)過電解的堿性還原水為6個(gè)或7個(gè)(H2O)的小分子水(自來水為14～16個(gè)),由于分子團(tuán)小,體積小,滲透力強(qiáng),所以容易進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞之間,導(dǎo)致堿性電解水的滲透力增強(qiáng)。自然界中的大分子團(tuán)水被迫解離成小分子團(tuán)水,由于不是自然產(chǎn)生,小分子團(tuán)水必須還原成大分子團(tuán)水,此時(shí)水分子與水分子在結(jié)合過程中快速運(yùn)動(dòng),形成高溶解力,所以導(dǎo)致堿性電解水具有較高的溶解力[14]。而傳統(tǒng)堿提是利用細(xì)胞在堿液中會(huì)吸水溶脹以致破裂,使細(xì)胞中的活性物質(zhì)釋放出來的原理提高提取率,若堿液濃度過高則會(huì)破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此,堿性電解水提取法較傳統(tǒng)堿提法溫和、破壞力小,且堿性電解水提取可有效減少堿法提取引起的污染性問題,同時(shí)堿性電解水作為功能性電解水制備過程中的副產(chǎn)物,它的利用也增加了電解水的附加值。

2.3 茶渣蛋白初提液蛋白酶酶解條件優(yōu)化

茶渣蛋白的酶法提取是近年來的熱點(diǎn),酶法提取不僅可以有效提高蛋白質(zhì)的提取率,同時(shí)還能改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)特性[24]。本研究為進(jìn)一步提高茶渣蛋白的提取率,嘗試了在堿性電解水的初提液中繼續(xù)添加堿性蛋白酶酶解的復(fù)合提取法,同時(shí)測(cè)定了酶解液的總抗氧化能力,以保證提取出的蛋白質(zhì)為活性蛋白。

2.3.1 酶解pH對(duì)茶渣蛋白提取率和總抗氧化能力的影響 不同酶解pH下蛋白質(zhì)提取率和總抗氧化能力如圖5。結(jié)果表明,pH為7.0～9.0時(shí)，隨著pH的增大,茶渣蛋白的提取率逐漸增高;當(dāng)酶解pH達(dá)到9時(shí),蛋白提取率最大(提取率為62%),此結(jié)果與鄒小明[11]、李圓圓等[24]的研究結(jié)果相同;繼續(xù)提高pH時(shí),蛋白提取率略微降低,說明當(dāng)pH為9時(shí),堿性蛋白酶的酶活最高,酶對(duì)底物作用效果明顯,這與堿性蛋白酶的最適pH相符(最適pH在9～11范圍內(nèi)),pH過高過低都會(huì)對(duì)蛋白酶活造成影響。因此,選定堿性蛋白酶酶解pH為9.0。此外,總抗氧化能力變化趨勢(shì)與蛋白提取率一致,均在pH9時(shí)達(dá)到最高。

圖5 酶解pH對(duì)蛋白提取率(A)和總抗氧化能力(B)的影響

2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)茶渣蛋白提取率和總抗氧化能力的影響 不同酶解時(shí)間下蛋白質(zhì)提取率和總抗氧化能力如圖6。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白提取率逐漸提高,酶解時(shí)間達(dá)到32 h時(shí),提取率最高(提取率為73%),但當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí),蛋白提取率變化趨于平緩。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng),底物不斷減少,酶解充分,因此確定最適酶解時(shí)間為32 h,且32 h后酶解液總抗氧化能力不再提高。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)蛋白提取率(A)和總抗氧化能力(B)的影響

2.3.3 酶添加量對(duì)茶渣蛋白提取率和總抗氧化能力的影響 不同酶添加量下蛋白質(zhì)提取率和總抗氧化能力如圖7。結(jié)果表明，隨酶添加量的增長(zhǎng),蛋白質(zhì)提取率逐漸提高,加酶量至2500 IU/g茶渣后提取率最高(蛋白提取率為83%),之后再增加酶使用量提取率增長(zhǎng)緩慢。一般而言,當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢?增加的酶量未使底物濃度飽和時(shí),則酶/底物值越大,反應(yīng)速度越大,蛋白質(zhì)的水解率越大。但酶/底物值過大,可能導(dǎo)致酶自身相互水解,酶活力降低,水解度降低[25]。酶的過量使用還會(huì)大幅度增加生產(chǎn)成本,綜合考慮后確定酶添加量為2500 IU/g茶渣,該添加量顯著低于趙立娜等[25]水解茶渣蛋白時(shí)添加的蛋白酶量(6000 U/g茶渣)。同時(shí),該加酶量下蛋白質(zhì)的抗氧化活性較高,達(dá)到668單位/mL。

圖7 加酶量對(duì)蛋白提取率(A)和總抗氧化能力(B)的影響

茶渣蛋白經(jīng)過堿性電解水及酶兩步提取后,蛋白提取率高達(dá)83%,較單一堿性電解水提取提高了34.7%,高于絕大多數(shù)已報(bào)導(dǎo)的研究結(jié)果[7,17,26]。鄒小明等[11]同樣采用復(fù)合法提取茶梗中的蛋白,用堿溶液初提后再添加蛋白酶進(jìn)行提取,提取率達(dá)到81.83%,提取水平與本研究相當(dāng)。同時(shí),該工藝條件下提取出的蛋白質(zhì)仍具有較高的總抗氧化能力,表明方法可行?；诒狙芯康慕Y(jié)果,可進(jìn)一步考慮結(jié)合其他處理技術(shù),如超聲輔助和微波輔助法,以期更加高效地提取茶渣蛋白。如陸晨等[8]采用超聲波技術(shù)輔助堿法提取蛋白,提取條件優(yōu)化后蛋白得率增高至86.5%;文靜等[14]采用微波輔助堿法提取茶渣蛋白,最高提取率可達(dá)89.01%。但傳統(tǒng)的氫氧化鈉堿提法存在一定弊端,如設(shè)備腐蝕、環(huán)境污染和安全隱患,選擇一種安全高效的新型處理方法具有重要意義。因此,堿性電解水以其易制備、無污染、安全性高的特點(diǎn)，在茶渣蛋白提取中具有顯著優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

堿性電解水提取后再添加堿性蛋白酶提取茶渣蛋白的方法效果較好,優(yōu)化后最佳工藝條件為:堿性電解水pH為12.5,提取溫度120 ℃,液固比為40∶1 (mL/g),提取時(shí)間40 min,堿性蛋白酶酶解pH9.0,酶解時(shí)間32 h,酶添加量2500 IU/g茶渣。在該條件下,蛋白質(zhì)提取率為83%,總抗氧化能力為668單位/mL。該復(fù)合提取法提取率高,且充分利用作為功能水制備過程中副產(chǎn)物的堿性電解水,為擴(kuò)大再生產(chǎn)提供了良好的理論依據(jù)。