楊 瑩，楊 英，陳曉紅，陳 林，梁翰月，羅 麗，賈常莎，袁 偉

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義 563006； 3.遵義市第一人民醫(yī)院，貴州 遵義 563002)

目前認(rèn)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是由遺傳與環(huán)境等多種因素相互作用引起的一種多基因疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，Aiolos基因可能是SLE的易感基因，我們結(jié)合近年來通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，IKZF1基因的rs2366293、rs1456896及Aiolos基因的rs9913957、rs8076347、rs8079075、rs907091、rs12150079[1-4]等位點(diǎn)在不同人群中被發(fā)現(xiàn)與SLE具有相關(guān)性。我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)一步探討Aiolos基因rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)多態(tài)性與貴州漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床表型的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 SLE病例組213例，來自我院就診的門診和住院病人，其中女性為197例，男性16例，年齡8～68歲，平均(32.93±12.15)歲，所有納入研究對(duì)象均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并對(duì)具備完整臨床資料的213例患者進(jìn)行分層分析。187例正常對(duì)照為同一時(shí)期在我院體檢的正常健康人群，年齡、性別構(gòu)成與病例組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且其一、二、三級(jí)親屬中均無SLE患者。所有納入對(duì)象均為貴州漢族人，患者之間、對(duì)照之間及患者與對(duì)照之間均無親緣關(guān)系，無近期感染，其他免疫性疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，全部研究對(duì)象知情同意后采集標(biāo)本。

1.2 資料與樣本收集 本研究的調(diào)查表包括一般情況(姓名、性別、就診年齡、家庭住址、聯(lián)系電話、文化程度和婚姻狀況等)、發(fā)病年齡、家族史、發(fā)病與懷孕及生育的時(shí)間關(guān)系、受累部位、主要臨床表型：蝶形紅斑、盤狀紅斑、光敏感、血液系統(tǒng)異常、腎臟病變、血沉、補(bǔ)體C3/C4、抗核抗體、抗ds-DNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗SSB抗體、抗SSA抗體、血尿、蛋白尿、管型尿和24 h尿蛋白等符合SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。研究對(duì)象均知情同意后，采集外周靜脈血2 mL置于真空抗凝管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA的提取和標(biāo)準(zhǔn)化 根據(jù)Magen DNA提取試劑盒按照產(chǎn)品說明書提取樣本基因組DNA，經(jīng)檢測(cè)其濃度后，標(biāo)準(zhǔn)化至50 ng/μL，置-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 Snapshot基因分型

1.3.2.1 PCR擴(kuò)增引物及 Snapshot引物 在位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)PCR引物，運(yùn)用primer5.0設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因公司合成(見表1～2)。

表1 PCR 擴(kuò)增引物

表2 SNaPshot單堿基延伸引物

1.3.2.2 多重PCR PCR反應(yīng)體積為30 μL，包括10×DNA聚合酶緩沖液3 μL，dNTP 2 μL，基因組DNA2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，引物混合1 μL，H2O 20.8 μL。多重PCR擴(kuò)增條件為96 ℃預(yù)變性2 min，96 ℃變性20 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，再次72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。

1.3.2.3 Snapshot反應(yīng) 采用美國ABI公司生產(chǎn)的ABI PRISM SNaPshot Muhiplex Kit進(jìn)行。反應(yīng)體系為5μL，其中PCR產(chǎn)物為3μL，SNaPshot Mix 0.5μL，延伸引物混合1 μL；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，12 ℃保存。

1.3.2.4 采用Snapshot技術(shù)在ABI 3730XL 型DNA 測(cè)序儀上對(duì)3個(gè)SNPs進(jìn)行分型(由北京六合華大基因科技有限公司完成)，基因分型由機(jī)器自動(dòng)讀取并做人工核定，為保證分型的準(zhǔn)確度，隨機(jī)挑選8例樣本進(jìn)行雙向測(cè)序，均未發(fā)現(xiàn)分型錯(cuò)誤。所選3個(gè)位點(diǎn)的分型成功率為98%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將資料整理好應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)比較病例-病例、病例組-對(duì)照組的等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)差異，計(jì)算P值、優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(95%confidence interval，95%CI)。對(duì)病例資料按照臨床表型整理分層，先對(duì)病例-病例進(jìn)行分析(如有蝶形紅斑和無蝶形紅斑患者之間)以確定Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)是否與各表型相關(guān)；然后進(jìn)行亞表型-對(duì)照分析(如有蝶形紅斑/無蝶形紅斑與健康對(duì)照組之間)以明確這些位點(diǎn)與SLE各臨床表型的關(guān)系。連鎖不平衡和單體型分析采用SHEsis 在線軟件進(jìn)行處理，P<0.05為差異或關(guān)聯(lián)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者的臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查 納入研究的SLE患者較為常見臨床癥狀有蝶形紅斑143例(67.1%)、盤狀紅斑9例(4.2%)、腎臟病變116例(54.5%)、光敏106例(49.8%)、血液系統(tǒng)異常58例(27.2%)；實(shí)驗(yàn)室檢查：抗核抗體陽性(ANA)198例(93%)、低補(bǔ)體(C3/C4)171例(80.3%)、抗SSA抗體陽性149例(70%)、抗SSB抗體陽性42例(19.7%)、抗RNP抗體陽性112例(52.6%)、抗Sm抗體陽性79例(37.1%)、抗核小體抗體陽性76例(35.7%)抗ds-DNA抗體陽性65例(30.5%)、血沉增快67例(48.2%)。

2.2 Aiolos基因三個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分布頻率與臨床表型、實(shí)驗(yàn)室檢查比較 病例-病例分析結(jié)果示：rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)等位基因頻率與SLE各臨床表型均無相關(guān)性(P均>0.05)。亞表型-對(duì)照分析表明，rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)等位基因頻率與SLE各表型均無相關(guān)性(P均>0.05)，見表3～4。

表3 SLE患者Aiolos基因三個(gè)SNP位點(diǎn)與臨床表型比較

表4 SLE患者Aiolos基因三個(gè)SNP位點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)室檢查比較

2.3 Aiolos基因三個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗(yàn)及單體型分析 對(duì)rs9909593、rs9635726、rs12150079這3個(gè)SNP 進(jìn)行兩兩間連鎖不平衡檢驗(yàn)，rs9909 593與rs12150079(D'=1，r2=0.613)、rs9635726與rs12150079存在完全連鎖不平衡(D'=1，r2=0.584)，rs9635726與rs9909593存在強(qiáng)連鎖不平衡(D'=0.877，r2=0.733)見表5。本研究采用SHEsis在線軟件進(jìn)行單體型種類和單體型頻率的估計(jì)，以最低頻率的閾值，即單體型頻率<0.03的不納入分析范圍的標(biāo)準(zhǔn)，Aiolos基因rs12150079、rs9635726、rs9909593共3個(gè)位點(diǎn)可構(gòu)建5種單體型(ACG、GCA、GCG、GTA、GTG)，在病例-病例分析(如比較有蝶形紅斑的SLE患者和無蝶形紅斑的SLE患者之間的分布無顯著性差異(P均>0.05)；在亞表型-對(duì)照分析(如比較有蝶形紅斑的SLE患者/無蝶形紅斑的SLE患者與正常對(duì)照之間的分布無顯著性差異(P均>0.05)，各單體型與SLE發(fā)病均無關(guān)，見表6～7。

表5 Aiolos基因3個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析(r2/D′)

表6 Aiolos基因各單體型分布頻率在病例-病例，病例-對(duì)照臨床表型關(guān)聯(lián)分析

表7 Aiolos基因各單體型分布頻率在病例-病例及病例-對(duì)照實(shí)驗(yàn)室檢查關(guān)聯(lián)分析

續(xù)表 Aiolos基因各單體型分布頻率在病例-病例及病例-對(duì)照實(shí)驗(yàn)室檢查關(guān)聯(lián)分析

續(xù)表 Aiolos基因各單體型分布頻率在病例-病例及病例-對(duì)照實(shí)驗(yàn)室檢查關(guān)聯(lián)分析

3 討論

SLE是一種累及全身多系統(tǒng)、多器官、臨床表現(xiàn)復(fù)雜的自身免疫性疾病，以多種自身抗體產(chǎn)生、補(bǔ)體激活、免疫復(fù)合物沉積，進(jìn)而導(dǎo)致組織和器官的損傷為基本特征。SLE病死率較高，患者生存質(zhì)量差。迄今為止，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為遺傳因素、環(huán)境因素及激素水平共同作用導(dǎo)致的免疫紊亂是SLE可能的發(fā)病原因。近年來對(duì)SLE的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究發(fā)現(xiàn)了許多與SLE有關(guān)的易感基因，該研究除了為發(fā)現(xiàn)SLE易感基因提供了直接證據(jù)外，同時(shí)為從基因組水平認(rèn)識(shí)SLE的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。此外，大量的遺傳學(xué)研究證明SLE與遺傳有著密切的關(guān)系，SLE屬于多個(gè)易感基因參與的多基因遺傳病[6]，SLE遺傳發(fā)病機(jī)制中其發(fā)病率和患病率在不同地區(qū)、種族有很大差異，SLE在某些人群中的發(fā)病率明顯高于其他人群，發(fā)病有家族聚集傾向，一級(jí)親屬的發(fā)病率明顯高于正常人群，說明SLE是一種多基因的疾病，SLE不僅受潛在患病風(fēng)險(xiǎn)基因的影響，而且受外界環(huán)境因素和非遺傳因素的影響，往往具有復(fù)雜多樣的表型，且表型和基因型之間也存在復(fù)雜的關(guān)系。因此，SLE臨床表型具有較大的異質(zhì)性，基因型-表型分析可以有助于闡明易感基因位點(diǎn)是否與該疾病的臨床表型相關(guān)，對(duì)于SLE的病因和發(fā)病途徑可能會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)。

Aiolos是一種鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，它屬于IKaros基因家族，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的發(fā)育，控制B細(xì)胞的激活、成熟及細(xì)胞表面抗原受體的轉(zhuǎn)換。近年來研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Aiolos在免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)以及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用[7-8]。越來越多的證據(jù)表明Aiolos基因在SLE 發(fā)病機(jī)制中有重要作用，與其他自身免疫病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等易感性也相關(guān)。美國近年的一項(xiàng)多種族GWAS研究[9]提示Aiolos基因中的rs8079075、rs9913957、 rs8076347 與歐洲SLE和非裔美國SLE均具有相關(guān)性，近期有研究[10-11]表明rs9909593、rs9635726這兩個(gè)位點(diǎn)可能與中國長江以南漢族人群SLE的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。我們?cè)缦葘?duì)SLE患者Aiolos基因mRNA及蛋白表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者Aiolos基因的mRNA及蛋白明顯降低，且與SLE活動(dòng)指數(shù)呈一定的相關(guān)性[12-13]。提示Aiolos基因的表達(dá)與SLE相關(guān)。而本次研究中亞表型-對(duì)照關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示Aiolos基因的rs9909593、rs9635726及rs12150079位點(diǎn)在病例-對(duì)照、病例-病例分析中，各項(xiàng)亞臨床表型組間等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，這三個(gè)位點(diǎn)與貴州地區(qū)漢族人群SLE的發(fā)病可能不存在關(guān)聯(lián)，但由于本次研究選取SNP位點(diǎn)及研究對(duì)象數(shù)量較少；患者在接受調(diào)查時(shí)的病程不同，隨著疾病的進(jìn)展以及治療過程的不同；遺傳和環(huán)境因素相互作用可能會(huì)影響某些臨床表型進(jìn)而影響分析結(jié)果。還需要進(jìn)一步對(duì)Aiolos其他多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行全面分析，從而深入的了解Aiolos基因與漢族人SLE臨床表型的關(guān)系。