朱 濤，王永翠

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，恩施 445000；2.恩施州婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，恩施 445000）

胃癌是比較常見的消化道惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中居前列，而且其病死率也較高，位于腫瘤致死率的第2位。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于食品安全及環(huán)境生化毒性物質(zhì)的累積，消化道腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。胃癌的早期診斷率較低，而且是一種多因素導(dǎo)致、致病機(jī)制復(fù)雜的腫瘤，在胃癌研究與診治方面仍然需要大量研究[1-3]。蘿卜硫素主要提取于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸酯類活性物質(zhì)，包括西蘭花、花椰菜及甘藍(lán)菜等[4]。近年來較多的研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以預(yù)防、延緩及逆轉(zhuǎn)腫瘤發(fā)生之前的病理改變，并且對多種腫瘤表現(xiàn)出較好的藥理作用[5-8]，也許會成為臨床上常用的抗腫瘤藥物。早期報道腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6（Traf6）/轉(zhuǎn)化生長因子-β活化激酶1（TAK1）信號通路的活化在細(xì)胞凋亡中起著重要的作用，Traf6作為一種銜接蛋白可以介導(dǎo)LTR4信號的傳導(dǎo)，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9-10]。賀云沖等[11]研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以抑制胃癌細(xì)胞的生長和侵襲，抑制炎癥因子的表達(dá)，也許是胃癌輔助治療的新途徑，但對其作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)研究Traf6/TAK1信號通路在蘿卜硫素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞（HGC27）凋亡中的作用。

1 材料及方法

1.1 藥品及試劑 蘿卜硫素（上海寶曼生物科技有限公司，批號：4478-93-7，純度≥99%）；DMEM培養(yǎng)基及0.25%胰酶（上海谷歌生物有限公司）；胎牛血清（美國 Gibco公司，批號：110524）；CCK8試劑盒（江蘇碧云天生物科技研究所，批號：WH1175）；Annexin-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物有限公司，批號：KGA106）；BCA試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，批號：WB0123）；SDS-PAGE試劑盒（武漢谷歌生物有限公司，批號：P1320）；兔抗人Traf6、TAK1、p-TAK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及β-actin等多克隆一抗（英國Abcam公司），HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 人胃癌細(xì)胞株HGC27購自武漢巴菲爾生物有限公司，HGC27細(xì)胞用1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，包含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，然后置于37℃、5%CO2的恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶底的90%左右時便可進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。然后取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板或6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的蘿卜硫素（15、30、60 mg/L）處理細(xì)胞，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活力檢測 取生長對數(shù)期細(xì)胞，0.25%Trypsin+0.02%EDTA 消化離心，計(jì)數(shù)后，以 1×104/孔細(xì)胞鋪96孔板，37℃、5%CO2的恒濕培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)過夜。然后分別加藥（正常組、15、30、60 mg/L組），分別培養(yǎng) 24、48、72 h后，使用 CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活力。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 取生長對數(shù)期細(xì)胞，然后以1×105/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，吸盡舊培養(yǎng)基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（15、30、60 mg/L）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育處理24 h后，除去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞3次，加入不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶進(jìn)行消化收集細(xì)胞，再用PBS清洗細(xì)胞3次，5 000 r/min離心6 min，收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸后加入5μL PI混勻，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測蛋白表達(dá) 取生長對數(shù)期細(xì)胞，然后以1×105/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，吸盡舊培養(yǎng)基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（15、30、60 mg/L）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育處理24 h后，收集細(xì)胞裂解，檢測蛋白濃度，然后每孔以50μg蛋白量上樣進(jìn)行凝膠電泳分離，電壓設(shè)置為70 V；待分離完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電流設(shè)定為275 mA、時間為70 min。接著將膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h，孵育一抗過夜，用TBST洗膜3次后室溫條件孵育對應(yīng)HRP標(biāo)記二抗1 h，再次洗膜3次，ECL顯影后便可進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測量方差分析，其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGC27細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)不同劑量蘿卜硫素作用后的HGC27細(xì)胞，生長活性受到不同程度的抑制，見表1。以正常細(xì)胞為對照，低劑量蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞的抑制率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著藥物濃度和處理時間的增加，HGC27細(xì)胞的增殖抑制率明顯升高，相對于對照組而言差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且細(xì)胞的增殖抑制率呈時間-濃度依賴性。

2.2 HGC27細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 不同劑量的蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果如圖1、表2所示。藥物處理細(xì)胞24 h后，與正常對照組相比，3種濃度藥物干預(yù)組中細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.05）。正常細(xì)胞的凋亡率為（5.42±0.42）%，而低、中、高劑量蘿卜硫素組中細(xì)胞的凋亡率上升至（12.52±1.21）%、（21.46±2.14）%及（33.41±3.94）%。

表1 蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞增殖的抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HGC27 cells%

表1 蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞增殖的抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HGC27 cells%

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與15μg/mL蘿卜硫素組比較，#P＜0.05；與 30 μg/mL 蘿卜硫素組比較，△P＜0.05；與本組藥物作用24 h 比較，▲P＜0.05；與本組藥物作用 48 h 比較，◆P＜0.05。

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圖1 蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 The effect of sulforaphane on the apoptosis of HGC27 cells

表2 蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞凋亡率的影響（Tab.2 The effect of sulforaphane on the apoptosis rates ofHGC27 cells（%

表2 蘿卜硫素對HGC27細(xì)胞凋亡率的影響（Tab.2 The effect of sulforaphane on the apoptosis rates ofHGC27 cells（%

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與15μg/mL蘿卜硫素組比較，#P＜0.05；與 30 μg/mL 蘿卜硫素組比較，△P＜0.05。

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2.3 HGC27細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax及Bcl-2表達(dá)水平檢測 采用Western Blot方法，以未加藥物處理細(xì)胞為對照，HGC27細(xì)胞經(jīng)低、中、高劑量蘿卜硫素作用24 h后，凋亡相關(guān)蛋白發(fā)生不同程度的變化，如圖2。其中促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達(dá)隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平則隨藥物劑量的升高而降低，他們與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表現(xiàn)出濃度依賴性。

2.4 HGC27細(xì)胞Traf6/TAK1信號通路蛋白檢測結(jié)果 采用Western blot方法，以未加藥物處理細(xì)胞為對照，HGC27細(xì)胞經(jīng)低、中、高劑量蘿卜硫素作用24 h后，Traf6/TAK1信號通路蛋白表達(dá)量發(fā)生不同程度的變化，如圖3。Traf6蛋白在蘿卜硫素的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，說明蘿卜硫素可以促進(jìn)Traf6表達(dá)；與此同時，TAK1的磷酸化水平也顯著升高，呈現(xiàn)出劑量依賴性，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此說明，蘿卜硫素可以通過活化Traf6/TAK1信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖2 蘿卜硫素對Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 The effect of sulforaphane on the expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 protein

圖3 蘿卜硫素對Traf6/TAK1信號通路的影響Fig.3 The effect of sulforaphane on the Traf6/TAK1 signaling pathway

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體保證內(nèi)環(huán)境平衡的自我調(diào)控機(jī)制[12]，細(xì)胞增殖與凋亡相互之間的穩(wěn)定在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[13]，細(xì)胞凋亡是一種程序化、多基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過程，這一過程在抗腫瘤的治療方面上已成為研究的主要方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素在15～60μg/mL濃度范圍內(nèi)，均可以表現(xiàn)出對胃癌HGC27細(xì)胞增殖的抑制作用，并且隨著藥物劑量及藥物作用時間的延長，細(xì)胞增殖抑制率也隨之顯著升高，呈現(xiàn)出一定濃度和時間依賴性。接著采用流式細(xì)胞儀對HGC27細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率隨著藥物劑量的升高而增加，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明蘿卜硫素可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并促使其發(fā)生早期凋亡。

TAK1受多種因素的刺激可以介導(dǎo)胞外信號的傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、Toll樣受體（TLR）、CD4及B細(xì)胞受體等細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號均可由TAK1的磷酸化發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[14]。研究報道Traf6表達(dá)水平上升可促使TAK1的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥、凋亡及氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生[15]。并且Trfa6/TAK1通路可介導(dǎo)TLR4信號傳導(dǎo)激活NF-κB通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9-10]。其中TAK1的磷酸化可以活化或者阻滯多條信號傳導(dǎo)，如Bcl-2/Bax、mTOR及Caspase-9等。其中Bcl-2/Bax通路蛋白在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中起著關(guān)鍵的作用，也是TAK1信號傳導(dǎo)的重要下游靶標(biāo)[16]。Bcl-2家族包括抗凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2）和促凋亡相關(guān)蛋白（如Bax）等，在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2/Bax蛋白含量的平衡在細(xì)胞是否發(fā)生凋亡中起著決定性作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素可以明顯誘導(dǎo)Traf6及p-TAK1水平，還抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并誘導(dǎo)了促凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)。于是，蘿卜硫素可以活化Traf6/TAK1的信號傳導(dǎo)，使Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量出現(xiàn)失衡，活化凋亡信號，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，蘿卜硫素能夠抑制人胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與活化Traf6/TAK1信號通路相關(guān)。