郭燕軍 ，劉洪利 ，陳 勇，閆 威 ，溫 凱

（1.滄州市中心醫(yī)院口腔頜面外科，滄州 061001；2.滄州醫(yī)學高等專科學校，滄州 061000）

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，近代藥理學研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠通過促進腫瘤細胞凋亡、影響細胞周期等不同作用機制對卵巢癌、宮頸癌、胃癌等起到一定的抑制作用[1-3]，而大蒜素是否能夠促進舌鱗狀癌細胞凋亡并影響其細胞周期尚未見文獻報道，本研究將通過體外培養(yǎng)人舌鱗狀癌Tca8113細胞并給予不同劑量大蒜素進行干預，探討大蒜素對舌鱗狀細胞癌細胞凋亡和細胞周期的影響，并初步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、藥物與試劑 人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞株由河北醫(yī)科大學病理生理學教研室惠贈。大蒜素注射液購自黑龍江迪龍制藥有限公司[規(guī)格：2 mL（30 mg）]；注射用順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司[規(guī)格：6 mL（30 mg）]；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自德國Bendermed公司；B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關 X 蛋白（Bax）引物購自上海博亞生物公司；cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2多克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥 實驗用細胞株經(jīng)解凍復蘇后體外培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為5×104/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，設空白對照組、大蒜素（50、25、12.5μg/mL）組和順鉑（40μg/mL）組，每組設12個復孔，給藥干預48 h后行各指標檢測。

1.2.2 細胞周期及細胞凋亡檢測 采用流式細胞術：各組細胞經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次后，加5 mL濃度為70%乙醇混勻，4℃環(huán)境放置48 h后，離心去除乙醇，PBS洗滌3次，加5μL濃度為10 mg/mL水解酶Rnase，1 h后加入濃度為100μg/mL的碘化丙啶染液，室溫避光孵育30 min后通過流式細胞儀進行分析檢測，采用CELLQuest軟件分析細胞周期時相及凋亡狀況。

1.2.3 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達檢測 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法：查閱大鼠Bcl-2、Bax、內(nèi)參β-actin基因cDNA序列并設計上、下游引物，常規(guī)消化并收集各組細胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA，測定總RNA濃度，取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行PCR反應，擴增完畢后，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達并計算Bax/Bcl-2值。

1.2.4 Cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達的檢測 采用蛋白免疫印跡法：超聲碎裂細胞，經(jīng)12 000 r/min低溫（4℃）離心20 min處理后取沉淀，BCA法行蛋白定量后實施高溫蛋白變性，電泳：待溴酚藍接近膠底部時停止、轉(zhuǎn)膜、麗春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2、β-actin（1∶500）4 ℃過夜；洗膜，二抗（1∶100）室溫搖床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞凋亡狀況Fig.1 Apoptosis of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cellsin each group

2 結(jié)果

2.1 細胞周期檢測結(jié)果 大蒜素（50、25μg/mL）組和順鉑組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞處于DNA合成前期（G0/G1）期比例較空白對照組顯著降低而DNA合成后期（G2/M）期比例顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示大蒜素能夠阻滯Tca8113細胞有絲分裂；與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組Tca8113細胞G2/M期比例顯著升高（P＜0.05），兩組間G0/G1期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞細胞周期（Tab.1 Cell cycle of human tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group（%

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05。

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2.2 細胞凋亡檢測結(jié)果 大蒜素（50、25、12.5μg/mL）組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞凋亡率為（73.1±8.6）%、（45.8±6.7）%、（21.3±5.9）%，順鉑組為（28.8±4.5）%，與空白對照組（2.4±1.5）%比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與順鉑組比較，大蒜素（50、25μg/mL）組Tca8113細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果見圖 1。

2.3 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA檢測結(jié)果 與空白對照組比較，大蒜素（50、25、12.5 μg/mL）組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞Bcl-2 mRNA表達顯著下調(diào)（P＜0.05 或 P＜0.01），大蒜素（50、25 μg/mL）組 Bax mRNA表達顯著上調(diào)、Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組Bcl-2 mRNA表達顯著下調(diào)、Bax/bcl-2比值顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表 2。

表2 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表達和 Bax/Bcl-2比值Tab.2 The expressions of Bcl-2 mRNA,Bax mRNA and theratio of Bax/Bcl-2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

表2 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表達和 Bax/Bcl-2比值Tab.2 The expressions of Bcl-2 mRNA,Bax mRNA and theratio of Bax/Bcl-2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05。

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表3 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2表達Tab.3 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

表3 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2表達Tab.3 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05。

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2.4 Cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達檢測結(jié)果 大蒜素（50、25μg/mL）組和順鉑干預組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞cyclin B1蛋白、CDK1蛋白較空白對照組顯著上調(diào)，cyclin D1蛋白、CDK2蛋白顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組cyclin B1表達顯著上調(diào)（P＜0.05），CDK2表達顯著下調(diào)（P＜0.01），兩組間 cyclin D1、CDK1 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2和表3。

3 討論

口腔頜面部腫瘤占全身惡性腫瘤10%左右，其中口腔鱗癌最為多見。舌鱗狀細胞癌占口腔癌40%左右[4]，具有生長快、浸潤性強、轉(zhuǎn)移率高、預后差的特點[5]，嚴重危害著人類的生命健康。目前，臨床上采用常規(guī)手術切除結(jié)合術前術后化療的治療方案，但治愈率僅30%左右，化療耐藥性的產(chǎn)生是療效降低并最終導致舌鱗狀細胞癌復發(fā)的主要原因。因此，迫切需要研究高效、低毒、敏感性高的新型抗腫瘤藥物。

圖2 各組人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達Fig.2 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cellsin each group

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，既往張飛鳳等[1]、劉玲等[2]、佘玉清等[3]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抑制卵巢癌SKOV-3細胞、宮頸癌Hela細胞、胃癌MKN-45細胞生長，且具有時間和劑量依賴性，其作用機制可能與大蒜素能夠通過破壞細胞結(jié)構、阻滯細胞有絲分裂、抑制細胞增殖等有關。本實驗研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大蒜素干預能夠阻滯細胞周期于G2/M期而抑制細胞有絲分裂，提高細胞凋亡率；并且與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組Tca8113細胞G2/M期比例顯著升高。

Bcl-2基因家族Bcl-2、Bax是細胞凋亡過程中重要的調(diào)控基因，其中Bcl-2能夠抑制細胞色素C釋放、抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）激活、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度，從而表現(xiàn)出抑制細胞凋亡的作用[6]；Bax具有破壞線粒體滲透性、激活Caspase-3而表現(xiàn)出促細胞凋亡作用[7]；Saeedi Borujeni MJ等[8]研究發(fā)現(xiàn)Bax與Bcl-2能夠聚合成二聚體，從而相互抑制活性，所以Bax/Bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)兩者對細胞凋亡的實際調(diào)控作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大蒜素干預能夠顯著下調(diào)人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞Bcl-2mRNA表達、上調(diào)BaxmRNA表達而顯著提高Bax/Bcl-2比值，這可能是大蒜素誘導Tca8113細胞凋亡的重要分子機制之一。

細胞周期過程有多種基因蛋白參與調(diào)控，其中周期蛋白依賴性激酶CDK2是細胞周期G2期運行的必要因子，而CDK1則調(diào)控腫瘤細胞從G2期過渡到M期，從而使細胞進入細胞分裂周期[9]。周期相關調(diào)控蛋白周期蛋白Cyclin B1是G2/M期的重要調(diào)控蛋白，Cyclin B1能夠與CDK1組成促有絲分裂因子（MPF），MPF能夠促使細胞G2期過渡到M期。本實驗研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大蒜素干預能夠顯著上調(diào)人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞cyclin B1蛋白和CDK1蛋白表達，顯著下調(diào)cyclin D1蛋白和CDK2蛋白表達，這可能是大蒜素通過阻滯細胞有絲分裂而抑制Tca8113細胞增殖的重要分子機制。

綜上所述，大蒜素可能通過促進細胞凋亡、阻滯細胞有絲分裂而對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞生長起到一定的抑制作用，其分子機制可能與大蒜素影響凋亡相關調(diào)控基因（Bcl-2、Bax）及細胞周期相關調(diào)控蛋白（cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2）表達有關。