賈少丹,李靖,劉偉,紀(jì)霞

(山東青島市市立醫(yī)院干部保健科，青島 266071)

Apelin 是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，是由同一基因編碼的具有不同分子結(jié)構(gòu)的一組內(nèi)源性活性肽，它是血管緊張素Ⅱ1 型受體相關(guān)蛋白(APJ)的內(nèi)源性配體，該類肽通過作用于APJ參與胰島素敏感性、心血管功能、氧化應(yīng)激及炎癥等病理生理過程，與糖尿病多種微血管并發(fā)癥關(guān)系密切。本研究應(yīng)用四引物擴(kuò)增受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)技術(shù)，測定2型糖尿病患者Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性，探討Apelin在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2016年6月至2017年5月在我院門診就診和住院的2型糖尿病患者121例為研究組，診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)尿清蛋白與肌酐(UACR)的比值是否≥30 mg/gCr，分為正常蛋白尿組(NA組:UACR<30 mg/gCr)和微量清蛋白尿組(MA組:UACR 30～300 mg/gCr)。其中NA組58例，男27例，女31例；年齡范圍28～65歲，年齡(48.3±14.7)歲；MA組63例，男30例，女33例，年齡范圍29～62歲，年齡(46.6±11.5)歲。選擇同期健康體檢者60例為健康對照組，男28例，女32例；年齡范圍27～62歲，年齡(47.2±13.7)歲。并經(jīng)葡萄糖耐量試驗(yàn)排除糖尿病。

所有研究對象肝功能、尿素氮和血肌酐均正常，排除尿路感染和其他腎臟疾病患者。所有參加本研究者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床指標(biāo)和生化指標(biāo)檢測 所有研究對象由專人測量身高、體質(zhì)量、腰圍、血壓，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。各受試者于采血前夜22:00 后禁食,次晨抽取肘靜脈血5 mL，其中3 mL送檢生化指標(biāo)如空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FIns)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及；余2 mL在-80 ℃冰箱保存，用于DNA提取和酶聯(lián)免疫吸附法檢測Apelin水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FPG×FIns)/22.5。

1.2.2 基因組DNA提取 應(yīng)用美國Promega公司DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明提取全血基因組DNA，提取后的DNA應(yīng)用微量核酸蛋白測定儀(NanoVue超微量分光光度計(jì)，英國)進(jìn)行定性、定量分析，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物合成 根據(jù)Genebank中提供的基因組序列由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)T-ARMS-PCR引物，其中(1)內(nèi)引物-上游引物5′-CCCCCTGCACCATCTGCTT-3′，下游引物5′-GGGACAGGGATCTAGTAGCAGGAAG-3′；(2)外引物-上游引物5′-AAGTGGTGCAGGGTATCCTTGGGT-3′，下游引物5′-AAGGAGCCAAGGAGGAAC AGAGC-3′。

1.2.4 DNA擴(kuò)增條件 PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，包括模板DNA 100 ng，四引物各1 μL(10 mmol/L)，10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 0.5 μL(10 mmol/L)，MgCl21.5μL(25 mmol/L)，TaqDNA 聚合酶為0.15 μL(5 u/μL)，加雙蒸水至25 μL。所有試劑均由Fermentas公司提供。PCR反應(yīng)條件：①95 ℃預(yù)變性5 min，②95 ℃變性30 s，③61 ℃退火30 s，④72 ℃延伸60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃終末延伸10 min。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證 應(yīng)用2%瓊脂糖制膠，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL進(jìn)行凝膠電泳，EB染色，以DL-600DNA片段長度為參考標(biāo)準(zhǔn)，使用培清JS-780A 全自動凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性結(jié)果 PCR產(chǎn)物電泳后于208 bp和458 bp處出現(xiàn)兩條帶者為野生純合型TT；于295 bp和458 bp處出現(xiàn)兩條帶者為突變純合型CC；于208 bp、295 bp和458 bp處出現(xiàn)三條帶者為突變雜合型TC。見圖1。

2.2 三組研究對象Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性比較 三組研究對象Apelin基因rs2235306位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。MA組CC基因型頻率及C等位基因頻率明顯高于NC組(χ2值分別為4.591、4.082，P值為0.032、0.043)；與NA組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NA組CC基因型頻率及C等位基因頻率與NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

注：M為DL-600maker；1、2、5為CC基因型；3為TT基因型；4、6為TC基因型

圖1Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性

2.3 糖尿病組Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性與其他臨床指標(biāo)的關(guān)系 由于人群CC型基因分布頻率少，因此采用TC+CC與TT比較。糖尿病組TC+CC基因型與TT基因型比較，F(xiàn)Ins、HOMA-IR和Apelin水平明顯升高(均P<0.05)。見表2。

2.4 Apelin的影響因素分析 以Apelin為因變量，年齡、腰圍(WC)、BMI、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、FIns、HOMA-IR為自變量的多元逐步回歸分析顯示Apelin與HOMA-IR和BMI正相關(guān)(t=4.078、2.071,均P<0.05),因此，HOMA-IR和BMI是Apelin的獨(dú)立相關(guān)因素(r2分別為0.148和0.171，均P<0.05)。見表3。

表3 Apelin與其他指標(biāo)的多元逐步回歸分析

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，起病隱匿，以微量清蛋白尿?yàn)樵缙诒憩F(xiàn)，其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。許多研究顯示細(xì)胞因子和炎性反應(yīng)參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。Apelin是1998年被發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)同源，具有降血壓、增強(qiáng)心肌收縮力、促進(jìn)胰島素分泌及垂體激素的釋放等多種生物學(xué)效應(yīng)[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)Apelin不僅參與了眾多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而且在肥胖相關(guān)疾病——2型糖尿病中起重要作用。此外，Apelin還與腎臟疾病也有一定的關(guān)系。

表1 糖尿病亞組和健康對照組Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性分布比較[例(%)]

注：與NC組比較,aχ2=4.591,P<0.05;bχ2=4.082,P<0.05

表2 糖尿病組Apelin基因rs2235306位點(diǎn)多態(tài)性與其他臨床指標(biāo)的關(guān)系

注：BMI為體質(zhì)指數(shù)，WC為腰圍，SBP為收縮壓，DBP為舒張壓，TC為總膽固醇，TG為三酰甘油，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，F(xiàn)PG為空腹血糖,HOMA-IR為胰島素抵抗指數(shù)，下表同

Apelin 表達(dá)分布廣泛，在腎臟組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞都有表達(dá)。體外研究表明Apelin-APJ系統(tǒng)以自分泌或旁分泌的方式誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管形成[6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)Apelin通過促進(jìn)腎小球上皮細(xì)胞增殖和增加腎小球毛細(xì)血管的通透性兩方面在糖尿病腎病發(fā)生中發(fā)揮作用。曾翔俊等[8]的研究也表明Apelin/APJ在2型糖尿病小鼠及2型糖尿病患者腎臟組織中表達(dá)上調(diào)，上調(diào)表達(dá)的Apelin/APJ系統(tǒng)促進(jìn)腎小球微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)并促進(jìn)2型糖尿病小鼠腎小球毛細(xì)血管增生，從而參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。人類Apelin 基因位于X染色體q25-26.1段，含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，mRNA長度是2673 bp。rs2235306位點(diǎn)存在于Apelin基因啟動子區(qū)，存在T-C的變異，本研究發(fā)現(xiàn)MA組CC基因型及C等位基因頻率高于NC組(P<0.05)，NA組CC基因型頻率及C等位基因頻率與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此推測Apelin基因rs2235306位點(diǎn)C等位基因攜帶可能與2型糖尿病早期腎損害有關(guān)。

胰島素抵抗是早期糖尿病腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而Apelin/APJ系統(tǒng)與肥胖、胰島素抵抗密切相關(guān)。Krist等[9]研究發(fā)現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗患者的血清Apelin水平明顯升高，而且減少脂肪組織Apelin的表達(dá)有助于提高胰島素敏感性。國內(nèi)黎英榮等[10]研究發(fā)現(xiàn)血清Apelin濃度與血清胰島素水平和HOMA-IR呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示糖尿病組人群TC+CC基因型組與TT基因型組比較，F(xiàn)Ins、HOMA-IR和Apelin水平明顯升高，多元逐步回歸分析顯示HOMA-IR和BMI是Apelin的獨(dú)立相關(guān)因素，提示Apelin與胰島素抵抗密切相關(guān)。因此，推測Apelin 可能在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

Apelin是一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)肽，目前關(guān)于Apelin和APJ在基因水平與疾病的相關(guān)性研究尚未普遍開展，因此，Apelin基因多態(tài)性與糖尿病腎病的相關(guān)性機(jī)制還需進(jìn)行大樣本的深入研究和探索。