劉磊，劉健，黃傳兵，萬磊，諶曦

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，合肥 230031)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種可致多系統(tǒng)受累的、慢性、侵襲性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為基本病理特征?；そM織血管增生形成血管翳對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的侵蝕，是造成RA關(guān)節(jié)功能障礙的最主要原因。近年來血小板參數(shù)及血小板微粒的異常表達(dá)[1-2]、促血管生長(zhǎng)因子/抑制血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)失衡[3-4]成為RA關(guān)節(jié)病變發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。本研究通過觀察AA大鼠外周血血小板微顆粒(PMPs)、血小板參數(shù)(PLT、PCT、PDW、MPV)、滑膜組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、內(nèi)皮抑素(ES)及滑膜微血管密度(MVD)的變化，以探討PMPs、血小板參數(shù)及VEGF、ES在RA病變中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼喂 雄性清潔級(jí)SD大鼠24只，購(gòu)于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(皖)2015-06]，大鼠體質(zhì)量(200±20) g，飼喂于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房，動(dòng)物房環(huán)境保持安靜，溫度18～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，保持通風(fēng)排氣10～20 次/小時(shí)。

1.2 試劑 弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CD31檢測(cè)試劑盒、SP試劑盒和DAB試劑免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；Trizol購(gòu)自INVITROGEN公司提供(批號(hào)：15596-026)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司(批號(hào)：K1622)；熒光定量試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(批號(hào)：CW0956)；引物由INVITROGEN公司合成；藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD41、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD61抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)為B188064、B181084。標(biāo)準(zhǔn)熒光微珠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，yellow-green 1um，批號(hào)：MKBT2841V。

1.3 主要儀器 足趾容積測(cè)量?jī)x：北京吉安得爾科技有限公司，型號(hào)：YLS-7B；電子天平：上海力衡儀器儀表有限公司，型號(hào) MXX-5001；Sysmex XT-2000i 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀器；組織石蠟包埋機(jī)：德國(guó)徠卡(LEICA)公司，型號(hào)：A130395；石蠟切片機(jī)：德國(guó)LEICA公司，型號(hào)：RM2245；組織脫水機(jī)：德國(guó)LEICA公司，型號(hào)：ASP300S；漂片機(jī)：美國(guó)伯明斯頓(Bloomington)公司，型號(hào)：MP-220；烘片機(jī)：德國(guó)LEICA公司，型號(hào)：HI1220；染色機(jī):德國(guó)賽利(SLEE)公司，型號(hào)：MAS。顯微鏡：日本奧林巴斯 (OLYMPUS)公司，型號(hào)：T-Gradient Thermoblock 96 PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Biometra公司；Epics XL 型流式細(xì)胞儀:美國(guó)Beckman-coulter公司。

1.4 方法

1.4.1 模型復(fù)制及指標(biāo)檢測(cè) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對(duì)照(NC)組、模型對(duì)照(MC)組，每組12只。向模型組大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑致炎，注射量為0.1 mL/100 g，制成佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型。致炎后30 d用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉，無菌環(huán)境下取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)滑膜組織CD31表達(dá)計(jì)算滑膜MVD值、PCR法檢測(cè)滑膜組織VEGF mRNA、ESmRNA表達(dá)；取外周血流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板微粒表達(dá)。

1.4.2 足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)測(cè)定 足趾腫脹度(E)：分別在模型復(fù)制前1天、致炎后30天測(cè)量各組大鼠足跖容積，計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度。足跖腫脹度[5]=(Vt-Vn)/Vn×100%(Vn、Vt分別代表致炎前后足跖容積)。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)：致炎后第30天觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，根據(jù)未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積積分，計(jì)算出各組大鼠AI。0分:無紅腫;1分:小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分:趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹[6]。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來,即為每只大鼠的AI分值。

1.4.3 大鼠滑膜JPI、MVD、ES、VEGF的檢測(cè) 關(guān)節(jié)病理?yè)p傷指數(shù)(JPI)評(píng)定：末次用藥24 h后將動(dòng)物處死，切開大鼠右側(cè)足趾關(guān)節(jié)。各組大鼠取后足遠(yuǎn)端趾間關(guān)節(jié)，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣5周；脫鈣完全后，石蠟包埋，切片，HE染色。采用HE染色方法進(jìn)行分級(jí)評(píng)定[7]。即為每只大鼠的JPI值。

MVD的檢測(cè)：末次用藥24 h后將動(dòng)物處死，無菌環(huán)境取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，固定、包埋、切片后行免疫組織化學(xué)學(xué)染色。CD31抗體按1∶100稀釋，顯色后封片，以細(xì)胞胞漿或胞核中出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。免疫組織化學(xué)染色的半定量判定：采用圖像分析軟件(美國(guó)Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng),美國(guó)Media Cybernetics公司)進(jìn)行圖像分析,按照Weidner的方法[8]進(jìn)行著色的微血管計(jì)數(shù)即為微血管密度(MVD)值。

滑膜VEGF、ES mRNA檢測(cè)：PCR法檢測(cè)大鼠滑膜ES、VEGF的表達(dá)。取大鼠滑膜組織用勻漿器勻漿，用Trizol試劑盒提取總RNA按照M-Mulv反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物序列：VEGF序列：Forward 5′-CGG TTC CAG AAG GGA GAG GA -3′，Reverse 5′- CTG GGA CCA CTT GGC ATG G-3′；ES 序列Forward 5′- CGG GTC ATG CGG ACA GTTC GC-3′，Reverse 5′-CCG GAC TGT TCG GCT GAG GT-3′；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析，數(shù)據(jù)分析計(jì)算方法為 2-△△Ct，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4 外周血血小板參數(shù)、血小板微粒的檢測(cè) 血小板參數(shù)的檢測(cè)：采用Sysmex XT-2000i 全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀器檢測(cè)大鼠血小板參數(shù)。

血小板微粒的檢測(cè)：末次用藥24 h后，腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.35 mL/100 g)麻醉，打開腹腔，行腹主動(dòng)脈采血2 mL，以枸櫞酸鈉抗凝，800 r/min室溫離心20 min，分離血漿，上層液為富血小板血漿(PFP)，每管取PFP 50 μL，加入1 μL標(biāo)準(zhǔn)熒光微珠，CD61-FICT和CD41-PE各5 μL，加樣后室溫避光孵育30 min，使熒光單抗與血小板微粒特異性結(jié)合，檢測(cè)前用PBS溶液將容積調(diào)整至0.5 mL，上機(jī)檢測(cè)前取0.5 mL PBS中加入1 μL標(biāo)準(zhǔn)熒光微球以直徑1 μm標(biāo)準(zhǔn)熒光微球進(jìn)行定位對(duì)照及設(shè)門，對(duì)門內(nèi)顆粒(微顆粒直徑在0～1 μm) 進(jìn)行分析，CD61-FITC和CD41-PE雙陽性顆粒為PMPs。結(jié)果經(jīng)FACSAria流式細(xì)胞儀FlowJo軟件進(jìn)行分析后輸出。

2 結(jié)果

2.1 AA大鼠外周血PMPs及血小板參數(shù)的變化 與NC組比較，MC組PMPs、血小板參數(shù)PLT、PCT明顯升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 AA大鼠外周血CD61+CD41+PMPs的表達(dá)

2.2 各組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 致炎30天，與NC組相比較，MC組大鼠E、AI顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠足趾腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化

2.3 各組大鼠JPI、MVD、VEGF、ES的變化 與NC組相比較，MC組大鼠JPI、MVD顯著升高，滑膜VEGF mRNA顯著升高，滑膜ES mRNA顯著降低，VEGF mRNA /ES mRNA顯著升高。見表3及圖2。

表1 AA大鼠外周血PMPs及血小板參數(shù)的變化

注：AA為佐劑性關(guān)節(jié)炎，PMPs為血小板微粒，下表同

表3 各組大鼠JPI、MVD、VEGF、ES的變化

注：JPI為關(guān)節(jié)病理?yè)p傷指數(shù)，MVD為微血管密度，VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，ES為內(nèi)皮抑素

圖2 滑膜組織病理、CD31的表達(dá)及VEGF、ES溶解曲線

2.4 各組大鼠PMPs與實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，CD61+CD41+PMPs(%)與血小板參數(shù)PLT、PCT呈正相關(guān)；CD61+CD41+PMPs(%)與E、AI及JPI、MVD、VEGF mRNA、VEGF mRNA/ES mRNA呈正相關(guān)；血小板參數(shù)PLT與足趾腫脹度、MVD呈正相關(guān)；血小板參數(shù)PCT與E、AI呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血小板微粒與實(shí)驗(yàn)指標(biāo)相關(guān)性分析

注：表中為r值，aP<0.05

3 討論

RA滑膜組織血管新生、血管翳的形成，可破壞關(guān)節(jié)軟骨面，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)RA血小板細(xì)胞的異常變化與RA疾病活動(dòng)密切相關(guān)[9-10]。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為血小板活化、聚集可發(fā)揮凝血、止血、參與炎性反應(yīng)等作用，而最近的研究表明血小板活化后可通過分泌PMPs參與免疫調(diào)節(jié)、血管新生[10-11]等重要生理病理學(xué)進(jìn)程。而在RA的滑膜病變中，血管新生相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)失衡尤為顯著。血小板活化及血小板微顆粒表達(dá)異常、血管生長(zhǎng)因子的分泌失衡，可誘發(fā)一系列免疫平衡的紊亂引起滑膜血管增生。

佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型是現(xiàn)在較為認(rèn)可的RA動(dòng)物模型，弗氏完全佐劑造模后，動(dòng)物關(guān)節(jié)的持續(xù)、慢性病變與人RA病變相類似。本研究觀察到AA大鼠滑膜組織CD31表達(dá)顯著升高，MVD明顯上調(diào)，表明AA大鼠滑膜組織出現(xiàn)血管增生及血管翳的形成。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠滑膜VEGF mRNA顯著升高，滑膜VEGF mRNA顯著降低，VEGF mRNA /ES mRNA顯著升高，提示AA大鼠滑膜組織的微血管增生與VEGF的表達(dá)升高，ES表達(dá)降低及VEGF/ES的表達(dá)升高有關(guān)。

促血管生長(zhǎng)因子/抑制血管生長(zhǎng)因子失衡是RA血管增生的重要因素[12]。在多種以血管病理性增生為發(fā)病特征的疾病中VEGF與ES之間的表達(dá)失衡被認(rèn)為是誘導(dǎo)血管增生的發(fā)病機(jī)制之一[13-14]。VEGF可磷酸化胞內(nèi)酪氨酸殘基，誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞周圍局部基底膜分解。在缺氧環(huán)境下VEGF可增加血管通透性，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管芽誘導(dǎo)血管新生[15]。ES是已知研究發(fā)現(xiàn)的最有力的內(nèi)源性血管生成抑制因子，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、降低遷移及血管芽成管，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)發(fā)揮抗血管新生作用[16-17]。本研究中AA大鼠滑膜VEGF表達(dá)升高，ES表達(dá)降低，表明AA大鼠滑膜組織促血管生長(zhǎng)因子/抑制血管生長(zhǎng)因子狀態(tài)失衡，進(jìn)而促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致滑膜血管增生。

相關(guān)性分析表明PMPs與血小板參數(shù)PLT、PCT存在正相關(guān)；前期的研究證明AA大鼠存在血小板參數(shù)(PLT、PCT)及血小板活化因子(PAF)的異常升高，表明AA大鼠存在血小板異?；罨痆10-18]。本次研究中AA大鼠血小板參數(shù)(PLT、PCT)及PMPs表達(dá)率CD61+CD41+PMP%顯著高表達(dá)，表明AA大鼠血小板活化后血小板微粒釋放增多。進(jìn)一步的研究表明CD61+CD41+PMPs與E、AI、MVD、VEGF mRNA、VEGF mRNA/ ES mRNA呈正相關(guān)，提示PMPs的高表達(dá)導(dǎo)致AA滑膜組織VEGF/ES的平衡失衡。

PMPs是血小板細(xì)胞在活化后細(xì)胞膜向外伸展變形以出芽方式形成囊泡而釋放或偽足斷裂脫落進(jìn)入微循環(huán)所形成的小囊泡，其直徑一般小于1 μm[19]。PMPs具有整套的血小板膜蛋白和膜脂質(zhì)等結(jié)構(gòu)，其膜表面可表達(dá)血小板膜糖蛋白、血小板活化因子、粘附分子、整合蛋白等。有研究表明血小板微粒PMPs可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌增多[20]。而在多種血管病理性增生疾病中PMPs均存在異常表達(dá)[21-23]。因此AA大鼠PMPs表達(dá)升高可上調(diào)VEGF表達(dá)，導(dǎo)致促血管生成因子VEGF/抑制血管生成抑制ES平衡失衡，誘導(dǎo)滑膜組織血管新生及關(guān)節(jié)損傷。