唐鐵鑫，劉 慧，鄧禮荷，邱新華

（肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，廣東 肇慶 526040）

關(guān)鍵字：大蒜辣素；阿藿烯；合成；純化

大蒜（Allium sativumL.）廣泛用于藥品、食品和飼料添加劑[1-3]。大蒜中蒜氨酸被蒜酶催化分解產(chǎn)生大蒜辣素（allicin），再分解成阿藿烯（ajoene）等含硫有機(jī)化合物，有抗病原微生物、抗腫瘤、抗心血管疾病等作用[4-6]。美國(guó)、英國(guó)及歐盟藥典以蒜氨酸或大蒜辣素作為大蒜粉的含量測(cè)定指標(biāo)[1,7]。《中國(guó)藥典》采用大蒜素（alltride）作為大蒜含量測(cè)定指標(biāo)，但該指標(biāo)存在異議[1,8]。直接以大蒜為原料制備分離大蒜辣素、阿藿烯，成本高、難度大[4,7,9-11]。以烯丙基二硫化物為原料可合成大蒜辣素[4,10]，用大蒜辣素可合成阿藿烯[4]，本文研究相關(guān)工藝改進(jìn)。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；LC 10A高效液相色譜儀（日本島津）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠）；CPA225D十萬分之一精密分析天平（德國(guó)賽多利斯）；PURELAB flex3超純水儀（英國(guó)ELGA）；CXG-A電腦恒溫層析柜（廣州恒創(chuàng)）；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TF-FD-1L實(shí)驗(yàn)室真空冷凍干燥機(jī)（上海田楓）。

1.2 藥品與試劑

80 %烯丙基二硫化物（allyl disulfide）、對(duì)羥基苯甲酸丁酯（butyl parahydroxybenzoate，分析對(duì)照品，純度＞99.5 %）（上海阿拉?。?，分析純甲酸、冰乙酸、30 %過氧化氫、氫氧化鉀、丙酮、甲醇、二氯甲烷、正己烷（廣州化學(xué)試劑廠），色譜純的甲醇和乙腈（瑞典Oceanpak），超純水（實(shí)驗(yàn)室制備）。大蒜（市售），研碎后凍干制成。

2 方法與結(jié)果

2.1 大蒜辣素和阿藿烯的檢測(cè)

參考《英國(guó)藥典》大蒜粉中大蒜辣素含量測(cè)定方法[12]檢測(cè)大蒜辣素，但在等度洗脫9 min后增加一個(gè)梯度洗脫過程，檢測(cè)弱極性物質(zhì)且避免前一次樣品分析殘留的成分干擾下一次樣品分析。

色譜柱為安捷倫ZORBAX色譜柱-SB-C18（5μm，150 mm×4.6 mm），流動(dòng)相A為1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為純甲醇，0～9 min，60 % B；9～12 min，線性增至80 % B；12～18 min，80 % B；18～20 min，線性遞減至60 % B；20～22 min，60 %B。流速0.8 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量5 μl。

取對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)照品20.5 mg，精密稱定，加甲醇-水（1:1）溶液溶解轉(zhuǎn)移入100 ml量瓶，稀釋定容，作為內(nèi)標(biāo)溶液。按1 mg 對(duì)羥基苯甲酸丁酯對(duì)應(yīng)8.65 mg大蒜辣素計(jì)算含量[12]。按照文獻(xiàn)[12]方法制備大蒜粉供試品溶液，合成大蒜辣素樣品和合成阿藿烯樣品按各試驗(yàn)項(xiàng)下的具體方法制備。

主要樣品和對(duì)照品的色譜圖見圖1，測(cè)得每1 g大蒜粉中含有3.92±0.01 mg（n=2）大蒜辣素。

圖1 實(shí)驗(yàn)中主要樣品和對(duì)照品的色譜圖

2.2 大蒜辣素合成研究

取烯丙基二硫化物0.7 ml溶于冰乙酸，定容至5 ml，置冷?。? ℃）中冷卻。在快速攪拌下，將5 ml過氧化氫乙酸溶液（0.7 ml 30 %過氧化氫溶解于5 ml冰乙酸中）逐滴加入烯丙基二硫化物乙酸溶液中反應(yīng)，反應(yīng)完后繼續(xù)在冷浴下快速攪拌4 h，加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入100 ml量瓶，稀釋定容至刻度；再分別吸取0.2 ml置入10 ml量瓶，加入0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液，再加甲醇-水（1:1）溶液稀釋定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。另外一組試驗(yàn)中，反應(yīng)完后繼續(xù)于20 ℃快速攪拌，分別于1，2，4，6 h準(zhǔn)確取樣0.2 ml，分別加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀釋定容至刻度；再分別吸取5 ml置入10 ml量瓶，加入0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液，再加甲醇-水（1:1）溶液稀釋定容，然后測(cè)定。

結(jié)果，冷浴中反應(yīng)4 h反應(yīng)生成大蒜辣素129.3±7.0 mg；于20 ℃分別反應(yīng)1，2，4，6 h，分別生成大蒜辣素：147.6±1.1 mg，207.3±2.2 mg，271.3±10.0 mg，353.1±2.6 mg（n=2）。以時(shí)間（T/h）為橫坐標(biāo)、產(chǎn)物質(zhì)量（M/mg）為縱坐標(biāo)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，得到直線擬合方程為M＝39.55×T＋116.3，R2＝0.9905，反應(yīng)符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。反應(yīng)6 h后，烯丙基二硫化物基本消耗完畢（圖1 B）。

2.3 大蒜辣素純化制備

取烯丙基二硫化物0.7 ml，按2.2項(xiàng)于20 ℃反應(yīng)6 h合成大蒜辣素粗品，參照文獻(xiàn)[9]，在快速攪拌和冰浴冷卻條件下，通過滴入氫氧化鉀溶液（2.15 g氫氧化鉀溶于蒸餾水，定容至2.5 ml）中和反應(yīng)混合物，如有鹽析出，加適量水溶解，分別加入等體積的正己烷、二氯甲烷各萃取一次；將未萃取的溶液、正己烷萃取后溶液和二氯甲烷萃取后溶液各取0.2 ml，分別加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀釋定容至刻度測(cè)定。

測(cè)得的色譜圖見圖2。正己烷基本將未反應(yīng)的原料和保留時(shí)間7.5 min后的成分萃?。▓D2 B）；二氯甲烷萃取后，溶液中大蒜辣素的含量降低（圖2 C）。萃取前溶液的大蒜辣素峰的峰面積為27 221.4（按照峰面積歸一化法，大蒜辣素峰的峰面積占66.7 %），正己烷萃取后減少至25 085.6，二氯甲烷萃取后減少至4421.2。正己烷萃取一次使溶液中大蒜辣素減少約7.8 %，而二氯甲烷萃取一次使溶液中大蒜辣素減少約82.4 %。因此，可用正己烷除去未反應(yīng)的原料，用二氯甲烷萃取純化大蒜辣素。

取二氯甲烷層1 ml減壓揮去溶劑，加甲醇-水（1:1）溶液溶解移入50 ml量瓶，稀釋定容至刻度測(cè)定，測(cè)得的色譜圖見圖1 E，按照峰面積歸一化法，大蒜辣素峰的峰面積占92.2 %。

圖2 液-液萃取處理對(duì)合成大蒜辣素的純化作用

2.4 大蒜辣素?zé)峤庵瓢⑥较┑难芯?/h3>

文獻(xiàn)[4]將大蒜辣素按10 %的體積比溶于40 %丙酮水溶液中，于64 ℃反應(yīng)4 h制取阿藿烯。參考該條件，將0.1 ml大蒜辣素按10 %體積比溶于溶劑中，分別進(jìn)行以下單因素試驗(yàn)。大蒜辣素分解產(chǎn)生阿藿烯的圖譜見圖1 C。

按照文獻(xiàn)[4]的反應(yīng)溫度64 ℃，分別加熱1，2，4，6，8 h，反應(yīng)后加甲醇-水（1:1）溶液溶解，移入10 ml量瓶，繼續(xù)稀釋定容至刻度；再分別吸取1 ml置入10 ml量瓶，再加甲醇-水（1:1）溶液稀釋定容，用0.45 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，阿藿烯峰生成量分別為：3.79±0.03，3.58±0.02，3.26±0.05，3.10±0.02，3.04±0.03 mg（n=2）。以時(shí)間（T/ h）為橫坐標(biāo)、阿藿烯的生成量（M/mg）為縱坐標(biāo)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，得到對(duì)數(shù)擬合方程為M＝-0.379 ln(T)＋3.807，R2＝0.9917，表明大蒜辣素于64 ℃很快生成阿藿烯，隨加熱時(shí)間增加，阿藿烯慢慢減少。

溶于40 %丙酮水溶液中，于30，40，50，60，80 ℃反應(yīng)4 h。結(jié)果，阿藿烯生成量分別為：1.49±0.04，2.50±0.04，4.33±0.04，4.80±0.01，4.07±0.01 mg（n=2），60 ℃下反應(yīng)生成量最高。

不加溶劑、溶于甲醇-水（1:1）水溶液、溶于甲醇中，于64 ℃反應(yīng)4 h。結(jié)果，阿藿烯峰的峰面積分別為：1.25±0.06，3.51±0.01，5.75±0.03 mg（n=2）。

2.5 阿藿烯的純化制備

根據(jù)2.4項(xiàng)結(jié)果，選擇將0.1 ml大蒜辣素按10 %的體積比溶于甲醇中，在60 ℃下加熱1 h，用甲醇-水（1:1）溶液稀釋，用0.45 μm微孔濾膜過濾，用反相高效液相色譜法分離制備阿藿烯。其中，色譜柱為Innoval C18半制備色譜柱（5 μm，100 ?，10 mm×250 mm），流動(dòng)相為甲醇－水（6:4），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，每次進(jìn)樣量為100 μl。柱后收集富含阿藿烯的洗脫部分，加食鹽至成飽和溶液，以二氯甲烷為溶劑萃取，二氯甲烷層加無水硫酸鈉脫水，低溫減壓揮去溶劑。純化后的阿藿烯產(chǎn)品的色譜圖見圖1 F，按照峰面積歸一化法，阿藿烯峰的峰面積占98.8 %。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)物的質(zhì)譜ESI-MS MRM(+)：m/z234.9；紅外光譜γ/cm-1：3080～2905, 1634, 1611, 1422, 1042 cm-1；核磁共振譜氫譜1HNMR（500 MHz，CDCl3）：δ 6.57 (d),5.9 (m), 5.4 (m), 5.2 (m), 3.5 (m), 3.38 (m)；核磁共振譜碳譜13CNMR （500 MHz，CDCl3）：δ134.58,132.47, 125.52, 123.77, 119.20,117.88, 54.79, 52.84,41.99，與文獻(xiàn)中阿藿烯波譜數(shù)據(jù)基本一致[4]。

3 討論

實(shí)測(cè)結(jié)果表明，大蒜凍干粉中大蒜辣素的含量不到0.4 %。用大蒜制備大蒜辣素，成本高、干擾成分多、分離純化較困難?；瘜W(xué)合成方法制備大蒜辣素，轉(zhuǎn)化率高、干擾成分少[4,10]。

將烯丙基二硫化物氧化成大蒜辣素的反應(yīng)，文獻(xiàn)[10]報(bào)道13 ℃下反應(yīng)呈零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，20 ℃時(shí)也為零級(jí)反應(yīng)。因此，在一定溫度下反應(yīng)足夠時(shí)間，使原料反應(yīng)完全，大蒜辣素不再增加；由于大蒜辣素不穩(wěn)定，隨后會(huì)分解減少。文獻(xiàn)建議溫度為10～30 ℃，但冰浴中反應(yīng)也產(chǎn)生了相當(dāng)于20 ℃下三分之一的大蒜辣素，表明即使在低溫下也能反應(yīng)生成產(chǎn)物。低溫下有利于避免分解，但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且溫度控制需增加設(shè)備和能耗，實(shí)際制備中可根據(jù)具體情況控制溫度和反應(yīng)時(shí)間。

由于大蒜辣素易分解，分離純化成為制備較高純度大蒜辣素的關(guān)鍵。文獻(xiàn)中采用乙醚萃取大蒜辣素[10]，乙醚易燃易爆，接觸空氣會(huì)慢慢氧化成過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定，加熱易爆炸，要避光嚴(yán)封保存，而且屬于易制毒二類溶劑，因此試驗(yàn)用二氯甲烷替代。通過液-液萃取方法，用正己烷除去未反應(yīng)的原料，用二氯甲烷萃取富集大蒜辣素，取得較佳純化效果。由于用制備液相色譜法進(jìn)一步制備成本高，大蒜辣素在除去溶劑的過程分解（結(jié)果表明，30 ℃下均分解產(chǎn)生阿藿烯），因此不再進(jìn)一步純化。

大蒜辣素在不同溫度下，在不同溶劑中，甚至不加溶劑均分解產(chǎn)生阿藿烯等一系列產(chǎn)物。64 ℃下加熱，反應(yīng)1 h產(chǎn)生的阿藿烯最多。但時(shí)間增加，阿藿烯的量下降較慢，表明阿藿烯穩(wěn)定性較好。文獻(xiàn)[4]報(bào)道用40 %丙酮作為溶劑溶解大蒜辣素進(jìn)行熱裂解，考慮到丙酮為易制毒溶劑，因此試驗(yàn)不加溶劑、甲醇水溶液和甲醇進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明，甲醇中反應(yīng)產(chǎn)量更高。文獻(xiàn)中熱裂解產(chǎn)生阿藿烯后，再以二氯甲烷為溶劑通過反復(fù)多次液-液萃取進(jìn)行富集，揮去溶劑后再通過正相HPLC法制備[4-5]。由大蒜辣素液-液萃取試驗(yàn)結(jié)果可見，二氯甲烷萃取并不能將阿藿烯與原料分開，而正相HPLC也不常用，因此，改用稀釋后直接通過反相HPLC法制備。

以烯丙基二硫化物合成大蒜辣素并進(jìn)一步合成阿藿烯，條件要求不高，易于在實(shí)驗(yàn)室開展。此法可用于為研究大蒜及其制品的質(zhì)量控制和藥理研究提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。