王立立，張 云，張相軍

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

鹽酸阿比多爾有干擾素作用，通過抑制流感病毒脂膜與宿主細(xì)胞的融合而阻斷病毒復(fù)制，對(duì)具有A、B型抗原的流感病毒的抗病毒活性最顯著；除具有殺滅病毒作用外，還有免疫調(diào)節(jié)作用，激活吞噬細(xì)胞，提高機(jī)體對(duì)病毒的抵抗能力；是用于治療A、B型病毒引起的流感和急性呼吸道病毒性感染的新型抗病毒藥物[1-3]。

二甲胺是鹽酸阿比多爾的合成原料，在體內(nèi)易與亞硝酸根反應(yīng)形成致癌性的N-亞硝基胺毒性物質(zhì)，從而對(duì)人體健康造成危害[4-6]。為了保證藥品安全性，有必要對(duì)鹽酸阿比多爾顆粒中的潛在雜質(zhì)二甲胺進(jìn)行控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1260）；Mettler Toledo XS205電子分析天平（梅特勒-托利多）；DKB-2006低溫恒溫槽（上海精宏）；TGL-16gR離心機(jī)（上海安亭）。

1.2 試藥

鹽酸二甲胺對(duì)照品（批號(hào)：H1527047，純度＞99.0 %），2,4-二硝基氟苯（批號(hào)：20160702，梯希愛，純度＞99.0 %）均購(gòu)自阿拉丁；鹽酸阿比多爾顆粒（批號(hào)：160928、161102、170416，石家莊四藥）；三乙胺（批號(hào)：20160203，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Pinnacie DB C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0.1 %磷酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：380 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 衍生試劑 精密量取1 ml 2,4-二硝基氟苯置入100 ml量瓶，用乙腈溶解并稀釋至刻度，臨用現(xiàn)配。

2.2.2 二甲胺對(duì)照溶液 取鹽酸二甲胺對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成濃度為5 μg/ml（以二甲胺計(jì)）二甲胺對(duì)照品貯備液。精密量取該貯備液1 ml至10 ml量瓶，加入100 μl三乙胺和1 ml生試劑，搖勻，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容至刻度，搖勻，過濾，作為二甲胺對(duì)照溶液和系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3 供試品溶液 精密稱取鹽酸阿比多爾粉末適量（約相當(dāng)于鹽酸阿比多爾10 mg），置入10 ml量瓶，加5 ml乙腈，超聲10 min后，加入100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑，搖勻，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容至刻度，搖勻，過濾。

2.2.4 空白溶液 分別精密量取5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑至10 ml量瓶中，搖勻，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容至刻度。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 分別取2.2項(xiàng)下空白溶液，對(duì)照溶液和供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，二甲胺衍生物峰與距離最近的衍生試劑所產(chǎn)生的峰分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以二甲胺衍生物計(jì)算不低于3000，滿足定量要求。見圖1。

圖1 鹽酸阿比多爾顆粒色譜圖

2.3.2 定量限 精密量取二甲胺對(duì)照品貯備液60 μl置入10 ml量瓶，依次加入5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑，搖勻后，60 ℃加熱30 min，冷卻后用乙腈定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣。按S/N=10計(jì)算定量限為0.30 ng。

2.3.3 線性關(guān)系的考察 取二甲胺對(duì)照品貯備液依次稀釋，獲得二甲胺濃度分別為0.03，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 μg/ml系列對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下對(duì)照溶液制備方法，2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以對(duì)照溶液的濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=167.59X- 0.4745，r=0.9999。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，二甲胺峰面積的RSD為0.6 %（n=6），結(jié)果表明方法精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算二甲胺的含量平均值為0.023 %，RSD為1.3 %（n=6）。

2.3.6 中間精密度試驗(yàn) 由不同實(shí)驗(yàn)人員采用相同操作方法，使用兩臺(tái)不同的高效液相色譜儀，重復(fù)上述重復(fù)性項(xiàng)下試驗(yàn)，儀器A（Agilent 1260）、B（島津20A）測(cè)得二甲胺的含量平均值為0.025 %，RSD為3.1 %（n=12）。

2.3.7 耐用性試驗(yàn) 通過改變流動(dòng)相初始比例、0.1 %磷酸溶液的濃度、流速、柱溫、波長(zhǎng)、不同品牌的色譜柱等參數(shù)的變化，系統(tǒng)適用性溶液的分離度均大于5.0，表明該方法的耐用性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為160928的供試品，精密稱定（約相當(dāng)于鹽酸阿比朵爾10 mg），共9份，置入10 ml量瓶，分別加入乙腈5 ml，超聲10 min，每個(gè)量瓶中依次加入對(duì)照溶液0.8，1，1.2 ml各3份，分別加100 μl三乙胺和1 ml衍生試劑，搖勻后，60 ℃加熱30 min，冷卻后，用乙腈定容。取續(xù)濾液進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定 取本品3批（批號(hào)：160928、161102、170416），按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，3批樣品中二甲胺的含量分別為：0.023 %，0.021 %，0.025 %。

3 討論

3.1 衍生條件選擇 本試驗(yàn)驗(yàn)證了不同的水浴溫度（50，60，70 ℃），不同的衍生時(shí)間（20，30，40 min），不同的三乙胺體積（80，100，120 μl）對(duì)衍生結(jié)果的影響，最后確定水浴溫度為60 ℃時(shí)，加入100 μl三乙胺反應(yīng)30 min最合適。

3.2 本文制定的柱前衍生化-HPLC能準(zhǔn)確地測(cè)定鹽酸阿比朵爾中二甲胺的含量，方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，為制劑的質(zhì)量可控性提供了科學(xué)的檢驗(yàn)方法。