張?chǎng)? 丁顯萍 張萍

摘 要：選取水稻品種（新優(yōu)188）的6個(gè)批次，即14-2、14-6，15-1、15-5，16-7、16-8，分別進(jìn)行DNA指紋鑒定及田間鑒定，將2種鑒定結(jié)果加以比較，結(jié)果表明，雜交水稻種子純度DNA指紋鑒定結(jié)果均低于田間鑒定的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：水稻；種子；純度；小區(qū)種植鑒定

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）13-0011-02

品種純度是指品種個(gè)體與個(gè)體之間在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)（或株、穗數(shù)）占供檢驗(yàn)本作物種子數(shù)（株、穗數(shù)）的百分率表示[1]。品種純度的高低對(duì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)都有較大影響，在種子生產(chǎn)、加工、貯藏及經(jīng)營(yíng)貿(mào)易中具有重要意義。DNA指紋方法是通過化學(xué)方法使水稻DNA從樣品中分離出來(lái)，棄除樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖及其它次生代謝物，以及樣品中加入的三氯甲烷、異戊醇、乙醇等試劑，獲得純化的DNA，作為PCR反應(yīng)的模板；對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物在電泳過程中的電荷效應(yīng)作用下進(jìn)行分離，通過顯色顯示水稻DNA譜帶類型。SSR標(biāo)記由于具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、遺傳上呈共顯性、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，已成為雜交水稻種子純度鑒定的一種理想分子標(biāo)記[2]。由于不同水稻品種遺傳組成不同，基因組DNA中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)有差異。這種差異可通過PCR擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠區(qū)分不同品種。田間鑒定是指選擇土壤均勻、肥力一致的田塊，配套適宜的栽培管理措施，對(duì)收獲的種子進(jìn)行小區(qū)種植鑒定，觀察品種的特征特性，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算結(jié)果。本研究將DNA指紋鑒定與田間種植鑒定的結(jié)果加以比較，以找出2種鑒定結(jié)果的差異，使DNA指紋鑒定的結(jié)果更有參考性。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料由安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司提供，分別為2014、2015和2016年入庫(kù)的新優(yōu)188種子，每年隨機(jī)選取2個(gè)批次，一共6批。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法 把選出的6批新優(yōu)188的種子編號(hào)為：14-2、14-6，15-1、15-5，16-7、16-8，用DNA指紋方法檢驗(yàn)各批的純度，記錄檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)在田間進(jìn)行小區(qū)種植鑒定，將田間的雜株類型記錄下來(lái)，計(jì)算純度結(jié)果，與室內(nèi)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.1 DNA指紋鑒定 （1）將選出的6批種子，先進(jìn)行發(fā)芽[3]，7d后選取合適的幼苗進(jìn)行引物篩選，選用其中2對(duì)引物RM297和RM190繼續(xù)純度檢測(cè)試驗(yàn)；（2）把每一批種子隨機(jī)取出400棵幼苗，研磨，加入提取液，水浴，再加入三氯甲烷、異戊醇、乙醇等藥劑，提取DNA；（3）制作反應(yīng)體系，根據(jù)NY/T1433-2014中的反應(yīng)程序進(jìn)行PCR，94℃下預(yù)變性2min，進(jìn)行30次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)（94℃下變性45S，55℃下退火45S，72℃下延伸1min），然后72℃下延伸8min，最后10℃恒溫冷卻；（4）將PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳及染色檢測(cè)，觀察膠片并記錄結(jié)果。

1.2.2 田間種植鑒定 （1）試驗(yàn)地選擇：考察田地前作狀況，同時(shí)選擇肥力一致且良好的田塊；（2）小區(qū)設(shè)計(jì)：在同一田塊將6個(gè)樣品相鄰種植，以突出它們之間的細(xì)微差異，每個(gè)樣品種植400株；（3）小區(qū)管理：在整個(gè)生長(zhǎng)階段檢查小區(qū)的植株?duì)顩r，觀察品種的特征特性，注意除草劑使用，避免影響植株的特征特性；（4）鑒定和記錄：在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)隨時(shí)觀察，重點(diǎn)在花期和成熟期，根據(jù)品種特性鑒定并記錄下雜株類型和數(shù)量[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA指紋鑒定結(jié)果 從表1可知各批種子DNA指紋鑒定的純度結(jié)果，每批鑒定株數(shù)均為400株，根據(jù)公式：純度（%）=（株數(shù)-R-A/B/S-其他雜株）/株數(shù)×100計(jì)算結(jié)果。14-2純度為96.3，14-6純度為97.5，15-1純度為96.8，15-5純度為96.5，16-7純度為97.8，16-8純度為97.0。

2.2 田間鑒定結(jié)果 由表2可知，田間鑒定各批株數(shù)為400株，通過對(duì)整個(gè)生育期的觀察，記錄各批種子的雜株類型，純度結(jié)果分別為98.8、99.0、99.0、98.5、99.8、99.3。

2.3 DNA指紋鑒定與田間鑒定結(jié)果的比較 將室內(nèi)檢測(cè)的純度結(jié)果與田間鑒定的結(jié)果加以比較，可以看出每批樣品的田間鑒定純度結(jié)果要高于室內(nèi)的結(jié)果，且都是高出1.5%以上，詳見表3。

3 討論與結(jié)論

比較DNA指紋鑒定與田間鑒定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)室內(nèi)的結(jié)果均低于田間。田間鑒定主要在水稻生長(zhǎng)過程中觀察其品種的特征特性，而DNA指紋鑒定是在室內(nèi)提取樣品的DNA，通過擴(kuò)增和電泳，得出結(jié)果。兩種方法原理不同，結(jié)果有差異，目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以田間鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。田間種植鑒定是當(dāng)前乃至今后一定時(shí)期內(nèi)種子質(zhì)量監(jiān)管的主要任務(wù)和各種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的重要工作[4]。但對(duì)于企業(yè)來(lái)說(shuō)，種子入庫(kù)大約在當(dāng)年的8月中下旬到12月底前后，而正季的田間鑒定是在次年的4月中旬播種，待整個(gè)生育期結(jié)束后才能看到純度結(jié)果。種子入庫(kù)后到播種之前就要包裝銷售，為了對(duì)市場(chǎng)負(fù)責(zé)，給包裝銷售提供可靠的依據(jù)，就需要室內(nèi)先進(jìn)行測(cè)純，了解種子的質(zhì)量情況。許多研究表明，利用DNA指紋鑒定技術(shù)鑒定品種真實(shí)性和純度的方法是可行的，檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確的[5]。雜交稻大田用種的純度標(biāo)準(zhǔn)必須高于96.0%，室內(nèi)測(cè)純的結(jié)果暫沒有標(biāo)準(zhǔn)可依，但根據(jù)近幾年的室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果和田間鑒定的結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)基本都是室內(nèi)測(cè)純結(jié)果偏低，若室內(nèi)測(cè)純的結(jié)果也以大田標(biāo)準(zhǔn)來(lái)規(guī)定，會(huì)有部分合格種子暫時(shí)不能包裝，如果室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的趨勢(shì)與田間一致，找出某個(gè)品種的室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果與田間鑒定結(jié)果的差異點(diǎn)數(shù)，不僅可提前為種子出庫(kù)質(zhì)量做參考，還能更準(zhǔn)確的掌握該品種的實(shí)際質(zhì)量水平。將入庫(kù)的種子及時(shí)包裝銷售到市場(chǎng)，為來(lái)年的銷售工作做好質(zhì)量保障。品種真實(shí)性和純度是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，對(duì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)具有直接的影響。因品種真實(shí)性和純度問題造成大幅減產(chǎn)的事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，加快分子檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用，是當(dāng)前種子質(zhì)量管理工作的一項(xiàng)重要而迫切的任務(wù)[5]。對(duì)企業(yè)而言，室內(nèi)純度檢測(cè)的準(zhǔn)確性更加重要，種子在進(jìn)入市場(chǎng)之前，質(zhì)量需要嚴(yán)格把關(guān)，純度是種子質(zhì)量指標(biāo)中尤為重要的一項(xiàng)，純度不合格會(huì)嚴(yán)重影響來(lái)年的收成和品質(zhì)。DNA指紋鑒定利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行純度鑒定這種鑒定方法適用于雜交水稻種子純度的快速鑒定。關(guān)鍵是要研究掌握室內(nèi)檢測(cè)與田間鑒定結(jié)果的關(guān)系，更清楚地了解品種特性，為市場(chǎng)銷售減少風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)格把好質(zhì)量關(guān)。

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（責(zé)編：張宏民）