侯 潔，肖俊睿，孫 玉，楊忠路，周 姝，周 巍，王 薇，李軍輝，楊本強(qiáng)*

(1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院放射診斷科，2.心外科，遼寧 沈陽 110016)

心肌缺血模型是心臟實(shí)驗(yàn)研究的重要手段。豬的心臟解剖結(jié)構(gòu)及冠狀動(dòng)脈供血情況等與人類較為接近[1]。本研究采用次全結(jié)扎冠狀動(dòng)脈法制作巴馬豬心肌缺血模型，并以CT冠狀動(dòng)脈成像(CT coronary angiography,CCTA)評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄程度、心臟磁共振(cardiac magnetic resonance,CMR)判斷心肌缺血情況，以期為研究缺血性心臟病(ischemic heart disease,IHD)提供可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選擇10只巴馬豬[北京實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地，許可證號(hào)SCXK(京)2013-0008]，體質(zhì)量20～30 kg，雌雄不限。本實(shí)驗(yàn)獲得我院動(dòng)物倫理委員會(huì)通過，實(shí)驗(yàn)人員均獲得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資格證書。

1.2 方法 在豬耳緣靜脈建立靜脈通路，靜脈注入丙泊酚麻醉，行氣管插管，連接麻醉機(jī)，術(shù)中吸入異氟烷麻醉。行心電監(jiān)測，靜脈注入舒芬尼。備皮消毒，于左側(cè)第3肋間切開約6 cm入胸，剪開心包，于左心耳與肺動(dòng)脈之間找到左前降支，剝離左前降支中遠(yuǎn)段表面心外膜，用彈力阻斷線懸吊此處左前降支，觀察心電圖變化及遠(yuǎn)端心肌改變約3～5 min，情況穩(wěn)定后，用4-0結(jié)扎線于彈力阻斷線位置將左前降支與22G留置針一同結(jié)扎，結(jié)扎后迅速將留置針抽出。心電圖示ST段改變、結(jié)扎部位以下心肌顏色變深時(shí)再觀察5 min，如無變化，止血后關(guān)閉心包，結(jié)束手術(shù)。術(shù)畢呼吸機(jī)輔助呼吸。于術(shù)前及術(shù)后2、12、24、48、72 h及1、2、4周行CCTA及MR檢查。術(shù)后4周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行病理檢查。

1.3 影像學(xué)檢查與圖像分析

1.3.1 CCTA 采用Philips Brilliance iCT 256層螺旋CT掃描儀，將實(shí)驗(yàn)豬麻醉后仰臥位保定，采取頭尾方向掃描，范圍自胸廓入口至膈下2 cm；采用高壓注射器，于耳緣靜脈留置管注射對(duì)比劑碘海醇(350 mgI/ml)，2 ml/kg體質(zhì)量，流率4.0 ml/s，后以相同流率跟注20 ml生理鹽水。當(dāng)主動(dòng)脈根部對(duì)比劑濃度達(dá)100 HU時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，延遲7 s后掃描。掃描參數(shù)：采用心電門控，管電壓120 kV，管電流800 mAs，有效層厚0.9 mm，層間距0.45 mm，管球轉(zhuǎn)速0.27秒/轉(zhuǎn)，有效層厚0.625 mm，準(zhǔn)直器128×0.625 mm。

將冠狀動(dòng)脈狹窄程度分為無狹窄、輕度狹窄(≤50%)、中度狹窄(>50%～≤75%)、重度狹窄(>75%～99%)及完全閉塞[2]。由2名主治醫(yī)師采用GE Advanced Workstation 4.5工作站以盲法行后處理分析，意見不一致時(shí)經(jīng)協(xié)商決定。

1.3.2 MRI 采用GE Discovery MR750 3.0T MR儀，將實(shí)驗(yàn)豬麻醉后仰臥位保定于氣墊，放于檢查床，使用專用心臟電極片，行平衡型快速穩(wěn)態(tài)自由進(jìn)動(dòng)序列(balanced fast imaging with steady-state free precession,FIESTA)掃描。①定位掃描：3-PL Loc FIESTA，TR 3.1 ms，TE 1.4 ms，F(xiàn)A 45°，層厚5 mm，層間距1 mm，F(xiàn)OV 35 cm×35 cm，矩陣192×192，于兩腔心、四腔心、大動(dòng)脈短軸位掃描；②T2W黑血序列，矢狀位雙反轉(zhuǎn)回波FSE T2W，TR 1 333.3 ms，TE 66.7 ms，F(xiàn)OV 35 cm×35 cm，矩陣256×256，兩腔心、四腔心掃描；③心臟四腔心屏氣FIESTA、短屏氣FIESTA電影，TR 3.5 ms，TE 1.6 ms，F(xiàn)A 45°，層厚5 mm，層間距1 mm，F(xiàn)OV 35 cm×35 cm，矩陣192×192，兩腔心、四腔心、動(dòng)脈短軸位掃描；④心肌灌注，F(xiàn)GRE Time Course，TR 2.5 ms，TE 1.2 ms，F(xiàn)A 20°，層厚5 mm，層間距1 mm，矩陣128×128，經(jīng)耳緣靜脈留置管注入對(duì)比劑歐乃影(釓雙胺)13 ml，跟注生理鹽水20 ml，流率5 ml/s，行兩腔心、四腔心、大動(dòng)脈短軸掃描；⑤延遲掃描：PS 2D PSMDE，TR 6.7 ms，TE 3.1 ms，TI 400 ms，F(xiàn)A 15°，層厚5 mm，層間距1 mm，矩陣256×192。灌注掃描結(jié)束即刻再以2 ml/s流率注入對(duì)比劑7 ml，并跟注生理鹽水20 ml，延遲20 min后行兩腔心、四腔心掃描。

將圖像傳至CVI 42軟件，根據(jù)美國心臟病協(xié)會(huì)建議的17節(jié)段分析法[3]，由2名主治醫(yī)師分別進(jìn)行圖像后處理，有分歧時(shí)經(jīng)協(xié)商解決。記錄左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV)及射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。

1.4 病理檢查 以TTC染色為判斷心肌是否存活的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，紅色為存活心肌，白色或灰白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)。將3.0 g氯化三苯基四氮唑(TTC)溶于300 ml 1.5%磷酸鹽緩沖溶液，避光放置于37℃恒溫水浴箱。對(duì)實(shí)驗(yàn)豬維持麻醉狀態(tài)下注射10% KCl溶液10 ml，死亡后即刻取出心臟，用生理鹽水沖洗并立刻自心尖到心底部于垂直室間隔方向切片，厚約1.0～1.5 cm，置入TTC溶液中進(jìn)行染色約20 min，拍照記錄后置于10%甲醛溶液固定1周，切片后HE染色觀察鏡下表現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以Kappa檢驗(yàn)分析延遲強(qiáng)化區(qū)與病理染色結(jié)果的一致性，Kappa≥0.75為一致性較好。計(jì)量資料服從正態(tài)分布，以±s表示，采用單因素方差分析各時(shí)段心功能指標(biāo)，兩兩比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

7只實(shí)驗(yàn)豬順利完成手術(shù)，3只死亡，其中1只麻醉過量死亡，2只術(shù)中心室顫動(dòng)死亡。建模成功率為70.00%(7/10)，見圖1A、1B。

2.1 CCTA 7只建模成功動(dòng)物中，6只左前降支遠(yuǎn)端在建模后嚴(yán)重狹窄甚至閉塞，狹窄程度約80%～100%，另1只開胸后發(fā)現(xiàn)心包粘連嚴(yán)重，難以分離左前降支，故次全結(jié)扎左心耳下方動(dòng)脈，術(shù)后CTCA證實(shí)結(jié)扎位置為左回旋支。

2.2 CMR與病理結(jié)果 TTC染色共檢測到37個(gè)梗死節(jié)段；CMR顯示109個(gè)(7×17)心肌節(jié)段，心臟電影可見部分心肌節(jié)段室壁變薄，運(yùn)動(dòng)減弱，首過灌注相應(yīng)部位心肌節(jié)段灌注減低，延遲掃描示36個(gè)延遲強(qiáng)化節(jié)段。結(jié)扎左回旋支實(shí)驗(yàn)豬，CMR檢查發(fā)現(xiàn)心肌缺血區(qū)域與左回旋支支配區(qū)域心肌一致。CMR檢測梗死節(jié)段與病理結(jié)果的一致性較好(Kappa=0.888)，見表1，圖1C、1D。光鏡下見結(jié)扎血管腔基本閉塞，梗死區(qū)域?yàn)樾募乃啦⒗w維化表現(xiàn)，見圖1E、1F。

圖1 次全結(jié)扎小型巴馬豬的大體、影像學(xué)和病理表現(xiàn) A.術(shù)中結(jié)扎遠(yuǎn)段心肌顏色較深，正常心肌呈粉紅色; B.建模4周后大體標(biāo)本，箭示結(jié)扎線; C.增強(qiáng)MRI示心肌延遲強(qiáng)化區(qū)域呈高信號(hào)“亮區(qū)”; D.豬心切片TTC染色后可見梗死區(qū)域心肌呈灰白色，正常心肌呈粉紅色，MRI延遲強(qiáng)化區(qū)域與病理TTC染色所示的梗死區(qū)域一致; E.結(jié)扎血管管腔基本閉塞，周圍見成團(tuán)炎性細(xì)胞浸潤(HE,×8); F.梗死區(qū)域心肌細(xì)胞胞漿嗜酸性增強(qiáng)，胞核消失，代之以大量增生的纖維組織(HE,×400)

方法基底部前壁前室間隔下室間隔下壁下側(cè)壁前側(cè)壁中部前壁前室間隔下室間隔CMR 梗死節(jié)段000011660 正常節(jié)段777766117TTC 梗死節(jié)段000011660 正常節(jié)段777766117方法中部下壁下側(cè)壁前側(cè)壁遠(yuǎn)段前壁室間隔下壁側(cè)壁心尖部CMR 梗死節(jié)段01166107 正常節(jié)段76611670TTC 梗死節(jié)段01177007 正常節(jié)段76600770

2.3 心功能比較 與術(shù)前相比，術(shù)后2周后不同時(shí)間點(diǎn)，LVEDV均增加(P均<0.05)；術(shù)后24 h后不同時(shí)間點(diǎn)，LVESV均增加、LVEF均下降(P均<0.05)，見表2。

表2 CMR測定建模前后不同時(shí)段心功能指標(biāo)比較(±s)

表2 CMR測定建模前后不同時(shí)段心功能指標(biāo)比較(±s)

時(shí)間LVEDV(ml)LVESV(ml)LVEF(%)術(shù)前40.45±21.6315.45±7.9462.71±8.33術(shù)后 2 h42.49±25.6718.08±11.9756.80±6.89 12 h43.23±24.5221.93±14.1954.04±9.33 24 h46.01±20.8930.99±10.34?52.28±4.13? 48 h50.53±23.8333.95±14.78?50.92±8.37? 72 h53.80±19.1936.07±14.84?49.14±10.48? 1周61.95±23.9439.98±16.93?46.99±9.23? 2周66.26±17.66?40.72±14.21?46.24±6.12? 3周70.68±22.86?41.85±14.99?46.11±8.46? 4周71.81±18.64?42.50±18.36?45.97±6.37?F值2.1013.6383.339P值0.0430.0010.002

注：*：與術(shù)前比較，P<0.05

3 討論

3.1 心肌缺血模型 細(xì)胞及基因治療IHD需要心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ?。豬、犬、兔、大鼠等均可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[5]，犬心臟側(cè)支循環(huán)豐富，不利于對(duì)梗死范圍及藥物療效做出評(píng)價(jià)[6]，而豬心肌缺血后側(cè)支循環(huán)缺乏，不需使用MRI專用小動(dòng)物線圈，且心臟較大，利于影像學(xué)觀察。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以巴馬小型豬作為建模對(duì)象，現(xiàn)有常規(guī)影像學(xué)設(shè)備可滿足實(shí)驗(yàn)需求。目前建模方法主要有開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈或球囊介入、充填栓子以及置入彈簧圈等[5]。臨床IHD多表現(xiàn)為左前降支病變[7]，故選取左前降支狹窄實(shí)驗(yàn)可更好地模擬缺血。介入手術(shù)操作難度較高，不易挑選較細(xì)的左前降支中遠(yuǎn)段，若阻斷近段，易造成心肌梗死面積過大，增加動(dòng)物死亡率[8]。彈簧圈外層為金屬，內(nèi)層酪蛋白吸水后膨脹，可加重血管狹窄程度[9]，其價(jià)格相對(duì)較貴，且引起梗死的時(shí)間和范圍變化較大，可控制性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可預(yù)見性較差。本研究采用開胸次全結(jié)扎左前降支中遠(yuǎn)段，直視下操作簡便，術(shù)野清晰、可靠，可大幅降低實(shí)驗(yàn)成本。

為提高建模成功率，須注意以下各點(diǎn)：①氣管插管需選用與動(dòng)物氣管匹配的球囊，并檢查是否漏氣；②宜選用左側(cè)第3肋間開口，因巴馬豬心臟異位率高(術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)6只右位心，術(shù)中證實(shí))；③結(jié)扎前應(yīng)用彈力阻斷線進(jìn)行預(yù)缺血實(shí)驗(yàn)；④以次全結(jié)扎術(shù)將左前降支中遠(yuǎn)段與彎折的留置針一同結(jié)扎，防止針頭隨心臟搏動(dòng)而刺破心臟，結(jié)扎后迅速將留置針輕柔抽離；⑤術(shù)中保持麻醉穩(wěn)定，注意動(dòng)物呼吸及心律變化，適當(dāng)應(yīng)用利多卡因等；⑥開胸前、術(shù)中、縫皮前均靜脈注入舒芬尼，以鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜。

3.2 影像學(xué)評(píng)估 本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比手術(shù)前后CTCA，可見結(jié)扎部位血管多完全閉塞或嚴(yán)重狹窄；CMR首過灌注顯示責(zé)任血管支配區(qū)域心肌出現(xiàn)灌注缺損，延遲掃描顯示相應(yīng)部位心肌延遲強(qiáng)化，與TTC染色結(jié)果具有較好的一致性；鏡下可觀察到梗死區(qū)域心肌壞死并纖維化，提示心肌缺血模型建立成功。

建模后實(shí)驗(yàn)豬心功能下降。Engblom等[10]指出，LVEF降低程度取決于梗死面積、微循環(huán)阻塞、心肌內(nèi)出血、遠(yuǎn)端心肌代償性肥大等多個(gè)因素。Wu等[11]認(rèn)為梗死心肌質(zhì)量、梗死百分比、受累段數(shù)等需超過一定程度才可影響心功能，故其對(duì)判斷預(yù)后的價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。CMR除可定量心腔容積、評(píng)價(jià)局部室壁運(yùn)動(dòng)及功能外，還可評(píng)估可挽救心肌、判斷梗死透壁程度以指導(dǎo)臨床治療和評(píng)估預(yù)后[12]。

3.3 優(yōu)勢與不足 臨床研究以患者作為試驗(yàn)對(duì)象，難以經(jīng)病理證實(shí)。以豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，可以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，模型穩(wěn)定，定位準(zhǔn)確，結(jié)果可靠。但本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，且動(dòng)物在檢查中不能嚴(yán)格控制呼吸及心率，對(duì)圖像質(zhì)量有一定影響，需進(jìn)一步增加樣本量，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提高圖像質(zhì)量。

總之，本研究結(jié)果表明，采用次全結(jié)扎豬冠狀動(dòng)脈法可建立良好的心肌缺血模型，進(jìn)行活體、多指標(biāo)的連續(xù)、動(dòng)態(tài)觀測，為臨床研究IHD提供依據(jù)。