曲功霖，王春燕，齊雪松，佟鵬

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國(guó)疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088）

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，具有治療心血管疾病、抗輻射、抗應(yīng)激反應(yīng)、抗衰老、增加機(jī)體免疫力等功效[1]，中國(guó)藥典規(guī)定紅景天藥用來(lái)源為景天科植物大花紅景天Rhodiolacrenulata（Hook. f. et Thoms）H. Ohba的干燥根和根莖[2]。本研究主要考察大花紅景天對(duì)小鼠體重及外周血象的影響，以探討大花紅景天對(duì)電離輻射所致造血功能下降的治療作用，并初步篩選出大花紅景天的抗輻射活性成分。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、材料及試劑

POCH-100iv Diff型血球儀（日本SYSMEX公司），725型紫外分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠），DZF-6030A型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），TP-214型分析天平（北京丹佛儀器有限公司），Milli-Q A10型純水儀（美國(guó)Millipore公司），D101型大孔吸附樹脂（北京慧德易科技有限責(zé)任公司），乙醇為分析純（北京化工廠）。

1.2 試藥

山柰素對(duì)照品（110861～200808）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。紅景天生藥購(gòu)自昆明中藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院張潔副教授鑒定，來(lái)源為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms）H.Ohba。將生藥粉碎后置于回流加熱裝置中，第1次加入約10倍量70%乙醇，浸泡30 min，大火煮沸后，文火（保持微沸狀態(tài)）煎2 h。采用60目篩網(wǎng)濾過(guò)，藥材中再加入約10倍量70%乙醇，大火煮沸后，文火煎2 h。合并2次提取液，水浴濃縮后60℃真空干燥為粉末，作為大花紅景天乙醇提取物，提取率為52%。

同法另置大花紅景天乙醇提取液，濃縮至生藥與濃縮藥液體積比約為1∶1，以離心半徑17.8 cm，10 000 r/min離心10 min，參照文獻(xiàn)[3]的提取方法，取上清液過(guò)D-101大孔吸附樹脂柱，以95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮后60℃真空干燥為粉末，作為大花紅景天乙醇提取物大孔樹脂吸附部分，即大花紅景天總黃酮，提取率為24%。以山柰素為對(duì)照品，采用紫外分光光度法檢測(cè)提取物中總黃酮含量為43.6%。

所有未吸附部分水浴濃縮后60℃真空干燥為粉末，為乙醇提取物大孔樹脂未吸附部分，即大花紅景天乙醇提取其余成分，提取率為28%。

1.3 照射條件

采用北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院鈷源60Coγ射線照射，小鼠單次全身照射的吸收劑量為3.5 Gy，劑量率為1.0 Gy/min，源靶距1.15 m。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方案

BALB/c小鼠60只，SPF級(jí)，雌雄各半，6～8周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（京）2014-0043，飼養(yǎng)條件為光照12 h，飼養(yǎng)溫度23～26℃，濕度40%。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后按體重編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，設(shè)正常組、對(duì)照組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組，每組12只。按臨床人用劑量推算大花紅景天生藥小鼠給藥劑量為0.9 g/kg，因此按提取率計(jì)算給藥劑量：乙醇提取物組為0.468 g/kg，總黃酮組為0.216 g/kg，乙醇提取其余成分組為0.252 g/kg。模型復(fù)制后立即灌胃給藥，20 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥7 d。正常組和對(duì)照組給予等體積的純水。

1.5 小鼠體重觀察

取照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)各組小鼠稱重，觀察體重變化。

1.6 小鼠外周血象觀察

小鼠接受全身一次性3.5 Gyγ射線照射，在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每只小鼠尾靜脈取血20μl，使用SYSMEX POCH-100iv Diff型血球儀檢測(cè)外周血象。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重比較

照射前，各組小鼠毛色及活動(dòng)正常。受照射后，正常組小鼠保持正常，對(duì)照組和給藥組小鼠出現(xiàn)不同程度的皮毛光澤度下降，精神萎靡，飲食及飲水量下降。

正常組、對(duì)照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16d的體重比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠體重有差別（F=52.725，P=0.000）；②各組小鼠體重?zé)o差別（F=0.878，P=0.483），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠體重與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③各組小鼠體重變化趨勢(shì)有差別（F=2.324，P=0.006）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 （n =12，g，±s）

表1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較 （n =12，g，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 20.24±0.98 20.48±1.15 19.83±1.08 19.93±1.29 20.16±1.57 20.38±1.63 20.90±1.69對(duì)照組 20.60±0.81 20.22±0.91 18.42±1.03 19.38±0.92 20.17±0.94 20.35±0.96 20.94±1.06乙醇提取物組 19.89±0.90 19.72±0.95 18.47±1.08 19.06±1.60 19.57±1.69 20.17±1.56 20.30±1.33總黃酮組 20.45±1.17 20.75±1.01 19.80±1.13 19.73±1.69 20.05±1.61 20.73±1.39 20.82±1.61乙醇提取其余成分組 20.14±0.82 20.28±0.93 19.06±1.11 19.45±0.84 19.77±0.85 20.65±0.95 20.53±0.91

圖1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重變化趨勢(shì)

2.2 各組小鼠外周血象比較

2.2.1 白細(xì)胞數(shù) 正常組、對(duì)照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測(cè)量的白細(xì)胞數(shù)比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠白細(xì)胞數(shù)有差別（F=68.131，P=0.000）。②各組小鼠白細(xì)胞數(shù)有差別（F=215.402，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠白細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）；乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組小鼠白細(xì)胞數(shù)與總黃酮組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③各組小鼠白細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)有差別（F=7.013，P=0.000）。見表2和圖2。

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血白細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

表2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血白細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 9.80±2.62 10.37±2.72 11.51±1.85 10.67±3.27 10.50±2.07 10.40±1.69 10.53±1.18對(duì)照組 9.00±0.98 2.09±1.13 1.48±0.56 3.08±1.60 2.62±0.93 2.55±0.47 3.82±1.25乙醇提取物組 8.80±2.45 2.49±0.83 1.98±1.03 3.03±1.21 4.88±1.51 3.10±1.14 4.42±1.05總黃酮組 9.38±3.47 2.59±0.60 1.83±0.62 3.33±1.76 5.02±1.37 3.93±1.25 4.43±1.33乙醇提取其余成分組 9.56±3.57 3.38±1.35 1.93±1.29 4.01±2.53 3.89±1.01 3.61±1.33 4.04±0.86

圖2 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)

2.2.2 紅細(xì)胞數(shù) 正常組、對(duì)照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測(cè)量的紅細(xì)胞數(shù)比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠紅細(xì)胞數(shù)有差別（F=13.401，P=0.000）。②各組小鼠紅細(xì)胞數(shù)有差別（F=7.907，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠紅細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）；總黃酮組紅細(xì)胞數(shù)高于乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組（P＜0.05）。③各組小鼠紅細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)有差別（F=2.543，P=0.001）。見表3和圖3。2.2.3 血紅蛋白 正常組、對(duì)照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測(cè)量的血紅蛋白含量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血紅蛋白含量有差別（F=18.265，P=0.000）。②各組小鼠血紅蛋白含量有差別（F=10.299，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠血紅蛋白含量高于對(duì)照組（P＜0.05）；總黃酮組血紅蛋白含量高于乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組（P＜0.05）。③各組小鼠血紅蛋白含量變化趨勢(shì)有差別（F=2.957，P=0.000）。見表4和圖4。

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血紅細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×1012/L，±s）

表3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血紅細(xì)胞數(shù)比較 （n =12，×1012/L，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 5.11±1.36 4.99±2.30 5.63±1.47 4.84±1.12 4.66±1.75 5.11±1.82 4.45±1.38對(duì)照組 4.40±0.91 4.41±2.17 3.69±1.53 2.95±1.60 2.65±1.32 2.73±0.77 4.15±1.38乙醇提取物組 4.86±1.03 4.38±1.03 5.74±1.89 3.03±1.26 3.19±0.96 3.55±1.14 5.31±2.06總黃酮組 5.17±0.32 5.66±1.20 7.40±2.16 4.90±1.32 4.02±1.12 5.21±1.61 4.97±1.41乙醇提取其余成分組 5.33±0.46 5.28±1.82 4.17±1.33 4.10±1.95 3.60±1.20 3.96±1.35 5.42±2.21

圖3 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)紅細(xì)胞數(shù)變化趨勢(shì)

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血紅蛋白含量比較 （n =12，g/dl，±s）

表4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血紅蛋白含量比較 （n =12，g/dl，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 7.38±2.43 7.28±2.25 7.79±1.39 7.10±1.52 6.49±0.77 7.34±1.75 7.07±1.80對(duì)照組 7.46±0.79 7.04±1.54 4. 77±1.44 4.71±1.81 3.37±0.53 4.50±1.01 6.36±1.98乙醇提取物組 7.58±1.58 6.58±1.55 7.26±1.71 4.90±1.53 4.96±1.49 5.21±1.60 7.06±1.89總黃酮組 7.66±0.80 8.80±1.37 7.92±1.26 7.70±1.49 6.43±1.42 7.91±1.73 7.08±1.75乙醇提取其余成分組 7.73±0.98 7.57±2.53 5.84±1.97 5.66±1.37 5.58±1.73 5.44±1.80 7.48±2.65

圖4 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血紅蛋白含量變化趨勢(shì)

2.2.4 血小板數(shù) 正常組、對(duì)照組、大花紅景天各成分組在照射前1 d，以及照射后1、4、7、10、13和16 d測(cè)量的血小板數(shù)比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血小板數(shù)有差別（F=54.470，P=0.000）。②各組小鼠血小板數(shù)有差別（F=9.906，P=0.000），正常組、乙醇提取物組、總黃酮組、乙醇提取其余成分組小鼠血小板數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）；總黃酮組血小板數(shù)與乙醇提取物組、乙醇提取其余成分組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③各組小鼠血小板數(shù)變化趨勢(shì)有差別（F=3.571，P=0.009）。見表5和圖5。

表5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血小板數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

表5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血小板數(shù)比較 （n =12，×109/L，±s）

組別 照射前1 d 照射后1 d 照射后4 d 照射后7 d 照射后10 d 照射后13 d 照射后16 d正常組 641.83±201.71 725.58±259.21 777.00±150.29 653.75±209.14 584.67±105.15 708.75±227.57 724.83±253.91對(duì)照組 621.92±173.69 471.92±117.63 545.50±177.65 273.67±129.33 249.58±115.29 402.92±133.95 723.92±241.80乙醇提取物組 686.42±186.13 568.67±162.50 759.17±215.70 278.75±110.42 334.67±62.54 510.08±142.26 810.75±151.37總黃酮組 702.58±139.14 681.25±164.89 789.83±260.23 386.83±106.04 340.50±90.84 624.92±91.82 688.33±138.83乙醇提取其余成分組 758.75±185.96 683.67±253.49 545.58±189.78 323.75±108.09 312.33±86.89 491.83±88.30 837.58±253.44

圖5 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)血小板數(shù)變化趨勢(shì)

3 討論

輻射損傷是一種病理、生理過(guò)程十分復(fù)雜的疾患，對(duì)人體的危害具有多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，1種或幾種化合物對(duì)輻射損傷的防治很難達(dá)到全面、高效和穩(wěn)定的效果。我國(guó)的傳統(tǒng)中藥含有多種成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和清除自由基等多種藥理活性，應(yīng)用在抗輻射作用方面可能起到綜合治療的作用。因此，許多具有活血、補(bǔ)血、抗氧化和增強(qiáng)免疫功能的中藥具有抗輻射作用潛力，可以作為輻射損傷防治候選藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題組對(duì)多種中藥進(jìn)行了抗輻射藥效的評(píng)價(jià)，其中大花紅景天對(duì)小鼠具有較好的輻射防護(hù)作用。為深入探討大花紅景天的輻射防護(hù)作用，采用化學(xué)分離方法針對(duì)大花紅景天的不同成分進(jìn)行抗輻射活性評(píng)價(jià)是十分必要的。已有對(duì)紅景天的化學(xué)成分研究結(jié)果表明，大花紅景天的化學(xué)成分主要包括醇苷類[4]、黃酮類[4-5]、多糖類[6]、揮發(fā)油類[7]等成分，其中對(duì)以紅景天苷為主的醇苷類成分研究較多，對(duì)黃酮等其他成分研究較少。而既往對(duì)紅景天屬植物的化學(xué)及藥理作用研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮具有抗氧化[8-9]、抗病毒[10]、抗腫瘤[11]等多種藥理活性。并且有觀點(diǎn)認(rèn)為，紅景天抗氧化作用的主要藥理活性成分是山柰素等黃酮類成分，而非紅景天苷[8]。因此本課題組推測(cè)，大花紅景天中的總黃酮可能具有良好的抗輻射活性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察大花紅景天的黃酮類成分對(duì)電離輻射損傷小鼠體重及外周血象的影響。

同時(shí)本課題組對(duì)大花紅景天的提取工藝研究表明，70%乙醇提取物的總黃酮含量遠(yuǎn)高于水提物，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙醇提取大花紅景天，然后經(jīng)大孔樹脂吸附的方法制備總黃酮。測(cè)定結(jié)果表明，大花紅景天總黃酮以山柰素計(jì)，含量為43.6%。

為全面評(píng)價(jià)大花紅景天中不同成分的抗輻射活性，本研究還比較了乙醇提取物、乙醇提取其余成分的抗輻射作用。為確保各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性，本研究以人臨床使用劑量推算小鼠給藥生藥劑量，各組小鼠均以此劑量作為給藥生藥劑量，然后通過(guò)各成分的提取率計(jì)算給藥劑量。

機(jī)體造血系統(tǒng)是對(duì)輻射高度敏感的組織，電離輻射可以導(dǎo)致骨髓抑制、造血組織功能障礙、造血微環(huán)境損傷等[12-14]，同時(shí)造血免疫功能在輻射后也明顯受抑制[13，15]，所以造血系統(tǒng)的恢復(fù)是評(píng)價(jià)藥物抗輻射活性的重要因素[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)3.5 Gy照射后，外周血象中白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和血小板數(shù)均下降；與對(duì)照組比較，乙醇提取物、總黃酮和乙醇提取其余成分對(duì)受照射小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板均表現(xiàn)出促升高的作用；而與乙醇提取物、乙醇提取其余成分比較，總黃酮對(duì)紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量的促升高作用明顯增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大花紅景天各成分具有明顯抑制γ射線輻射所致的小鼠外周血象降低的作用，其中總黃酮可能是主要的抗輻射活性成分。

大花紅景天總黃酮對(duì)外周血象各項(xiàng)指標(biāo)的影響表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)；與對(duì)照組比較，抑制白細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量和血小板數(shù)下降的作用最為顯著；而對(duì)紅細(xì)胞數(shù)降低的干預(yù)在受照射初期并不明顯。對(duì)于該現(xiàn)象的原因，有研究認(rèn)為，紅細(xì)胞存活時(shí)間比其他血細(xì)胞長(zhǎng)，生存壽命120 d，并且對(duì)放射不敏感，所以照射早期紅細(xì)胞并不出現(xiàn)明顯的數(shù)量、形態(tài)、血紅蛋白和血球容積等變化，而且在放射病早期，由于晚幼紅細(xì)胞繼續(xù)成熟，可能有網(wǎng)織紅細(xì)胞和紅細(xì)胞的一時(shí)增多[16-17]。

照射劑量的選擇也是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵問(wèn)題，劑量過(guò)小達(dá)不到模型復(fù)制的要求，劑量過(guò)大，小鼠輻射損傷嚴(yán)重甚至死亡，藥物治療難以逆轉(zhuǎn)。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究選擇3.5 Gy照射劑量復(fù)制模型小鼠，結(jié)果表明，模型小鼠可用于有效評(píng)價(jià)大花紅景天各提取成分的干預(yù)作用。

綜上所述，大花紅景天總黃酮有很好地抑制小鼠電離輻射損傷導(dǎo)致的外周血象下降的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為大花紅景天的抗輻射損傷物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了重要的參考依據(jù)。本課題組正在對(duì)大花紅景天總黃酮中的化學(xué)成分進(jìn)行分離，并采用更多的活性指標(biāo)進(jìn)行抗輻射活性篩選，以期為開發(fā)高效低毒、成分明確、質(zhì)控穩(wěn)定的新型輻射損傷防治中藥制劑產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。