劉瓊雯，李秋雨，孫松，李惠翔

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科，河南 鄭州 450052）

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤。缺氧微環(huán)境是惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素，缺氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia-inducible factors, HIF-2α）是為適應(yīng)缺氧而衍生出的一種堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helixloop-helix, bHLH）-PAS蛋白家族轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)促進(jìn)血管生成、調(diào)節(jié)增殖凋亡及誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[1-2]。Twist2也稱(chēng)為Dermo1，參與腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是癌細(xì)胞獲得遷徙、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的主要因子之一。有研究表明，Twist2是HIF-2α的特異靶基因之一[3]。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討兩者在乳腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年8月-2012年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的乳腺組織石蠟標(biāo)本143例。其中，乳腺非特殊浸潤(rùn)性癌92例作為乳腺癌組，癌旁正常組織30例作為癌旁正常組織組，纖維腺瘤21例作為纖維腺瘤組。92例乳腺癌組織來(lái)源于女性，年齡27～83歲，中位年齡47.50歲，平均年齡49.51歲；組織學(xué)分級(jí)I級(jí)11例，Ⅱ級(jí)62例，Ⅲ級(jí)19例；TNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期78例，Ⅳ期1例；伴有腋窩或鎖骨下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51例，未見(jiàn)轉(zhuǎn)移者41例。患者術(shù)前均未行放化療及內(nèi)分泌治療，手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋及切片染色，并由2位病理醫(yī)生進(jìn)行閱片及分類(lèi)。

1.2 試劑

鼠抗人HIF-2α單克隆抗體（ab8365）及鼠抗人Twist2單克隆抗體（ab57997）購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（SP-9000）及濃縮型二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine,DAB）試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色運(yùn)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素SP三步法，具體步驟如下：石蠟切片脫蠟、梯度酒精水化，抗原高壓熱修復(fù)、阻斷及封閉，滴加一抗4℃過(guò)夜（HIF-2α單克隆抗體1∶2 000、Twist2單克隆抗體1∶200），滴加生物素標(biāo)記的通用二抗及鏈霉卵白素-過(guò)氧化物酶，DAB染色、蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。本實(shí)驗(yàn)以PBS替代一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

在光鏡下呈現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒狀物質(zhì)即為顯色，HIF-2α蛋白陽(yáng)性染色主要定位于胞核，部分胞漿中也可見(jiàn)，Twist2蛋白陽(yáng)性染色主要定位于胞漿。在高倍鏡（10×40）下對(duì)每張切片隨機(jī)選擇8～10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，染色強(qiáng)度從無(wú)色到淺黃、棕黃及棕褐色分別計(jì)0～3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從0%、＞0%～10%、＞10%～25%、＞25%～50%、＞50%分別計(jì)0～4分；將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性百分比相乘，所得數(shù)值＞3即為陽(yáng)性表達(dá)[4]。

1.5 隨訪

患者的生存結(jié)局經(jīng)查閱病歷、電話等形式獲得，從術(shù)后第1天開(kāi)始計(jì)算到患者死亡或末次隨訪止為總生存時(shí)間，隨訪日期截止到2016年12月31日，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間59個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為44.78個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為47.00個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2或Fisher檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson法，影響因素的分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的HIF-2α、Twist2蛋白表達(dá)

乳腺癌組、癌旁正常組織組及纖維腺瘤組HIF-2α蛋白陽(yáng)性率分別為71.73%、36.66%和42.85%，其中92例乳腺癌中，HIF-2α陰性（-）26例（28.26%），弱陽(yáng)性（+、++）49例（53.26%），強(qiáng)陽(yáng)性（+++）17例（18.47%）。3組HIF-2α表達(dá)陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乳腺癌組高于纖維腺瘤組和癌旁正常組織組。3組Twist2蛋白陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），乳腺癌組高于纖維腺瘤組和癌旁正常組織組。見(jiàn)表1和圖1、2。

2.2 各臨床病理特征乳腺癌患者的HIF-2α、Twist2陽(yáng)性率比較

不同腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的HIF-2α陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移及雌激素受體乳腺癌患者的Twist2陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組HIF-2α、Twist2蛋白的比較

圖1 各組HIF-2α蛋白的表達(dá) （SP×200）

圖2 各組Twist2蛋白的表達(dá) （SP×200）

表2 各臨床病理特征乳腺癌患者的HIF-2α、Twist2陽(yáng)性率比較

續(xù)表2

2.3 乳腺癌組中HIF-2α、Twist2蛋白表達(dá)的相關(guān)性

乳腺癌組中HIF-2α、Twist2蛋白均陽(yáng)性表達(dá)35例（38.04%），均陰性表達(dá)14例（15.22%），HIF-2α蛋白陽(yáng)性而Twist2蛋白陰性患者5例（5.43%），HIF-2α蛋白陰性而Twist2蛋白陽(yáng)性患者9例（9.78%），乳腺癌中HIF-2α與Twist2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.452，P=0.000）。

2.4 HIF-2α、Twist2蛋白表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

乳腺癌HIF-2α、Twist2蛋白陰性患者5年生存率分別為96.1%和89.2%，乳腺癌HIF-2α、Twist2蛋白陽(yáng)性患者5年生存率分別為80.3%和78.6%，HIF-2α、Twist2蛋白陰性與陽(yáng)性患者5年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.599和5.515，P=0.018和0.023），兩者均為影響乳腺癌預(yù)后的因素。無(wú)論HIF-2α還是Twist2蛋白，其陰性患者生存曲線均較平緩，相對(duì)于陽(yáng)性患者擁有更高的5年生存率及更長(zhǎng)的生存期。見(jiàn)圖3、4。

將年齡、腫瘤大小、分級(jí)、分期等因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，多因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HIF-2α陽(yáng)性和腫瘤直徑＞2 cm可作為乳腺癌患者預(yù)后的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

圖3 乳腺癌HIF-2α陽(yáng)性與陰性患者的生存曲線

圖4 乳腺癌Twist2陽(yáng)性與陰性患者的生存曲線

表3 乳腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox多因素分析

3 討論

HIF-2α是20世紀(jì)90年代末提取出來(lái)的細(xì)胞因子，包涵bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域成分[5]。HIF-2α和最先在人類(lèi)基因組中發(fā)現(xiàn)且研究較為普遍的缺氧誘導(dǎo)因子-1α在結(jié)構(gòu)上有48%的氨基酸序列同源性?？杀蝗毖醐h(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)，在腎透明細(xì)胞癌、胰腺癌及肝癌等眾多腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及生存預(yù)后均存在關(guān)聯(lián)[6-9]。Twist2也稱(chēng)為Dermo1，該細(xì)胞因子的主要作用之一是與真皮發(fā)育相關(guān)，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，Twist蛋白家族是一種含有bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，Twist2和Twist1相比，其結(jié)構(gòu)相似性高達(dá)66%，但是兩者的功能尚不一致[10]。Twist2在多數(shù)非癌組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，而在眾多實(shí)體瘤中呈高表達(dá)，并參與細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，是癌細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的主要影響因素之一[11]。HIF-2α和Twist2均歸屬于bHLH-PAS家族成員，Twist家族是HIF-2α的特異靶基因，兩者參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、新生血管形成、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等過(guò)程[12]。研究顯示，缺氧微環(huán)境及HIFs介導(dǎo)的眾多低氧信號(hào)通路在誘發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial- mesenchymal transition,EMT）過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用[13]。YANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α在胰腺癌EMT中起關(guān)鍵作用，通過(guò)介導(dǎo)Twist2對(duì)E-cadherin進(jìn)行下調(diào)而引發(fā)EMT，從而引起腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。HIF-2α可以促進(jìn)體外癌細(xì)胞遷移侵襲，并調(diào)節(jié)E-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，對(duì)EMT的發(fā)生和進(jìn)行至關(guān)重要。ZHOU等[15]發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性囊腺癌細(xì)胞HIF-2a和Twist2的表達(dá)均高于低轉(zhuǎn)移性囊腺癌細(xì)胞，唾液腺囊腺癌HIF-2a和Twist2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤周?chē)窠?jīng)侵犯、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，并推測(cè)缺氧環(huán)境與EMT之間存在相關(guān)性。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是明確的判斷乳腺癌預(yù)后指標(biāo)之一，乳腺癌中HIF-2α和Twist2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)提示患者預(yù)后不良。HIF-2α可能通過(guò)Twist2介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，縮短生存期。HIF-2α和Twist2有可能作為乳腺癌預(yù)后判斷和靶向治療的生物學(xué)標(biāo)志物。