張懿，劉暢

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 錦州121000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematous,SLE）累及多系統(tǒng)、多器官，發(fā)病機制復(fù)雜[1-2]。茶多酚活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）對狼瘡性腎炎的調(diào)控作用顯著[3-4]。SSA/Ro52（Ro52）是SLE的關(guān)鍵調(diào)控靶點[5-9]，其調(diào)控機制可能與單核-巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10-13]。EGCG能顯著抑制正常體細(xì)胞中Ro52的表達(dá)[14]。然而，單核-巨噬細(xì)胞中EGCG與Ro52的功能和調(diào)控關(guān)系并不清楚。本研究旨在探索不同濃度EGCG對Ro52介導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞THP-1凋亡及炎癥反應(yīng)的調(diào)控效應(yīng)，為SLE發(fā)病機制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 主要材料 人單核-巨噬細(xì)胞THP-1（中國科學(xué)院上海微生物所菌種保藏中心），Ro52過表達(dá)質(zhì)粒（pCMV-Ro52）（北京Biovector公司）。

1.1.2 主要試劑及儀器 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素 -1β（Interleukin-1β, IL-1β）、IL-13檢測試劑盒購自美國Trevigen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Clontech公司），SYBR Green Master Mix（美國 Life Technologies公司），BCA蛋白檢測試劑盒、anti-Ro52、anti-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗體、辣根過氧化酶二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Abcam公司），膜聯(lián)蛋白-熒光素異硫氰酸酯（Annexin V-fluorescein isothiocyanate, AV-FITC）（美國 BD Pharmingen 公司），碘化丙啶（propidium iodide, PI）（美國Sigma公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Fermentas公司），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）（美國Millipore公司），酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（美國Santa Cruz公司）Image-Pro Plus 6軟件（美國 Media Cybernetics公司），BD FACSCalibur?系統(tǒng)（美國BD公司），Beckman CXP軟件（美國Brea公司）。

1.2 人單核-巨噬細(xì)胞THP-1的培養(yǎng)與分組

1.2.1 人單核-巨噬細(xì)胞THP-1的培養(yǎng) 在37℃、5%二氧化碳CO2條件下，用含10% FBS和1%青-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人單核-巨噬細(xì)胞THP-1。細(xì)胞2 d或3 d換液1次，細(xì)胞融合率達(dá)80%時，進行傳代，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106個/ml用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞分組 正常培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞為對照組，20μg pCMV-Ro52為 pCMV-Ro52組，20μg pCMVNC為pCMV-NC組[15]，以及Ro52過表達(dá)48 h后繼續(xù)使用0、5、10、20和50 mg/L EGCG處理24 h的0、5、10、20 和 50 mg/L EGCG 組[16]。

1.3 Ro52過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）對人源Ro52的cDNA（NM_003141.3）進行擴增，并且將產(chǎn)物插入pCMV質(zhì)粒，進行轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化篩選。將濃度為1.0×106個/ml的THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)，參考謝軍等[17]的研究，使用pCMV-NC質(zhì)?；蛘遬CMV-Ro52分別對THP-1細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。48 h后采用qRT-PCR進行擴增。Ro52正向引物：5’-AGAGAGACTTCACCTGTTCTGT-3’，反向引物：5’-TCAGTTCCCCTAATGCCACCT-3’。采用 Western blot檢測THP-1細(xì)胞中Ro52的表達(dá)。

1.4 qRT-PCR

參照qRT-PCR試劑盒說明書抽提細(xì)胞總RNA，采用Trizol試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將5.0μg RNA作為模板合成cDNA，用SYBR Green Master Mix進行基因表達(dá)的實時分析。反應(yīng)條件：95℃變性5 min，95℃延伸5 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)以倍數(shù)變化進行展示。GAPDH用于qRT-PCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.5 Western blot檢測

收集各處理組細(xì)胞進行裂解，并抽提總蛋白質(zhì)。采用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同大小的蛋白質(zhì)，用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）進行濕法轉(zhuǎn)膜。用3%脫脂牛奶對轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜室溫封閉1.5 h，PBS洗滌3次，5 min/次，采用一抗包括goat源性的Ro52（1∶900）和GAPDH（1∶2 000）4℃孵育過夜。洗去一抗，在室溫條件下用辣根過氧化酶二抗（1∶18 000）孵育1.5～2.0 h，洗滌抗體液。采用增強化學(xué)發(fā)光法顯影。Western blot檢測結(jié)果用Image-Pro Plus 6軟件進行圖像分析。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗

收集各組細(xì)胞，采用BD FACSCalibur?系統(tǒng)、AV-FITC及PI試劑盒，依據(jù)試劑盒說明書進行細(xì)胞凋亡檢測。主要步驟為：不同處理條件下的細(xì)胞以1.0×106個/ml的密度懸浮于100 ml結(jié)合緩沖液，將細(xì)胞用AV-FITC和PI孵育15 min，在FC-500流式細(xì)胞儀上使用Beckman CXP軟件進行分析。

1.7 ELISA

收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸液6 070 r/min離心15 min。將上清液收集并儲存于80℃，用于炎癥因子分析。根據(jù)試劑盒說明書進行操作，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13采用ELISA試劑盒進行檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ro52過表達(dá)效果

2.1.1 Ro52 mRNA 檢測pCMV-Ro52轉(zhuǎn)染48 h后對Ro52 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。對照組、pCMV-NC組、pCMV-Ro52組Ro52 mRNA相 對 表達(dá) 量 分 別 為（0.988±0.021）、（1.003±0.029） 和（2.558±0.418），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.543，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，pCMV-Ro52組Ro52 mRNA表達(dá)水平較對照組升高（P＜0.05）；而pCMV-NC組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與pCMV-NC組相比，pCMVRo52組Ro52 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

2.1.2 Ro52蛋白 對照組、pCMV-NC組、pCMVRo52組Ro52蛋白相對表達(dá)量分別為（0.989±0.021）、（1.000±0.065）和（2.291±0.815），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=62.134，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，pCMV-Ro52組Ro52蛋白表達(dá)水平較對照組升高（P＜0.05）；而pCMV-NC組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與pCMVNC組相比，pCMV-Ro52組Ro52蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，pCMV-Ro52轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞48 h可上調(diào)Ro52的表達(dá)。見圖1。

圖1 各組Ro52蛋白的表達(dá)

2.2 Ro52過表達(dá)對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

Ro52過表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Ro52轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后檢測其對THP-1細(xì)胞凋亡比例的影響。對照組、pCMV-NC組、pCMV-Ro52組THP-1細(xì)胞凋亡率分 別 為（2.401±1.030）%、（2.532±0.512）% 和（10.337±0.987）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=62.134，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，pCMV-Ro52組THP-1細(xì)胞凋亡率較對照組升高（P＜0.05）；而pCMV-NC組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與pCMV-NC組相比，pCMVRo52組THP-1細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，pCMV-Ro52轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞48h可上調(diào)THP-1細(xì)胞凋亡率。見圖2。

2.3 Ro52過表達(dá)對THP-1細(xì)胞炎癥因子水平的影響

Ro52過表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Ro52轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后對照組、pCMV-NC組、pCMV-Ro52組TNF-α、IL-1β、IL-13水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，pCMV-Ro52組 TNF-α、IL-1β、IL-13水 平較對照組升高（P＜0.05）；pCMV-NC組與對照組TNF-α、IL-1β、IL-13水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與pCMV-NC組相比，pCMV-Ro52組 TNF-α、IL-1β、IL-13水 平 升 高（P＜0.05）。結(jié)果表明，pCMV-Ro52轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞48 h可上調(diào)THP-1細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-1β與IL-13。見表1。

圖2 Ro52過表達(dá)對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

表1 各組炎癥因子水平的變化 （ng/ml，±s）

表1 各組炎癥因子水平的變化 （ng/ml，±s）

注：?與對照組、pCMV-NC組比較，P ＜0.05

組別 TNF-α IL-1β IL-13對照組 1.034±0.021 1.011±0.032 1.002±0.072 pCMV-NC 組 1.030±0.064 1.026±0.064 1.074±0.050 pCMV-Ro52組 2.233±0.491? 2.157±0.336? 2.335±0.316?F值 5.347 9.257 14.352 P值 0.002 0.001 0.001

2.4 EGCG抑制Ro52的過表達(dá)

使用0、5、10、20和50 mg/L EGCG處理過表達(dá)Ro52的細(xì)胞24 h，對照組，以及0、5、10、20和50 mg/L EGCG組Ro52蛋白相對表達(dá)量分別為（0.974±0.069）、（2.425±0.562）、（2.032±0.683）、（1.907±0.637）、（1.715±0.367）、（1.308±0.102），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.342，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與0 mg/L EGCG組相比，20和50 mg/L EGCG組Ro52蛋白水平降低（P＜0.05）；0 mg/L EGCG 組 與 10 mg/L EGCG 組 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；0 mg/L EGCG組與5 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.5 EGCG調(diào)控THP-1細(xì)胞凋亡

圖3 不同濃度EGCG對Ro52蛋白表達(dá)的影響

使用不同濃度（0、5、10、20和 50 mg/L）EGCG處理過表達(dá)Ro52的THP-1細(xì)胞24 h后，對照組，以及0、5、10、20和50 mg/L EGCG組THP-1細(xì)胞凋亡率分別為（2.362±0.213）%、（10.380±0.682）%、（10.061±0.123）%、（9.650±0.781）%、（6.352±0.902）%、（5.234±0.321）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=82.354，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與0 mg/L EGCG組相比，20和50 mg/L EGCG組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；0 mg/L EGCG組與10 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；0 mg/L EGCG組與5 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

2.6 EGCG阻斷Ro52對細(xì)胞炎癥因子的影響

2.6.1 TNF-α 使用不同濃度（0、5、10、20和 50 mg/L）EGCG處理過表達(dá)Ro52的THP-1細(xì)胞24 h后，對照組，以及0、5、10、20和50 mg/L EGCG組TNF-α、IL-1β、IL-13水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與0 mg/L EGCG組相比，20和50 mg/LEGCG組TNF-α水平降低（P＜0.05）；0 mg/L EGCG組與10 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；0 mg/L EGCG組與5 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.6.2 IL-1β對照組，以及0、5、10、20和50 mg/L EGCG組IL-1β水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與0 mg/L EGCG組相比，20和50 mg/L EGCG組 IL-1β 水平降低（P＜0.05）；0 mg/L EGCG 組與10 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；0 mg/L EGCG組與5 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖4 EGCG對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

表2 各組炎癥因子水平的變化 （ng/ml，±s）

表2 各組炎癥因子水平的變化 （ng/ml，±s）

注：?與0 mg/L EGCG組比較，P ＜0.05

組別 TNF-α IL-1β IL-13對照組 1.018±0.134 1.045±0.084 1.035±0.086 0 mg/L EGCG 組 2.308±0.276 2.096±0.257 2.322±0.374 5 mg/L EGCG 組 2.043±0.142 2.089±0.108 2.159±0.244 10 mg/L EGCG 組 2.012±0.291 1.977±0.172 1.947±0.138?20 mg/L EGCG組 1.725±0.224? 1.749±0.177? 1.737±0.452?50 mg/L EGCG組 1.266±0.260? 1.193±0.326? 1.187±0.258?F值 22.241 12.857 69.521 P值 0.001 0.000 0.000

2.6.3 IL-13 對照組，以及0、5、10、20和50 mg/L EGCG組IL-13水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，與0 mg/L EGCG組相比，10、20和50 mg/L EGCG組IL-13水平降低（P＜0.05）；0 mg/L EGCG組與 5 mg/L EGCG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

3.1 Ro52參與單核-巨噬細(xì)胞凋亡和破壞正常的炎癥因子水平

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Ro52既可以促進THP-1細(xì)胞凋亡，又可以促進THP-1細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-13的分泌。這說明，Ro52在單核-巨噬細(xì)胞的功能紊亂和炎癥因子分泌中發(fā)揮調(diào)控作用。單核-巨噬細(xì)胞在SLE的起病過程中發(fā)揮重要作用，包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、清除凋亡細(xì)胞等[18]，同時還發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答啟動過程中是多種細(xì)胞因子的重要來源[19]。TABAS等[20]研究表明，SLE相關(guān)的并發(fā)癥，如狼瘡腎炎的早期和進展期均可出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞的異常凋亡，巨噬細(xì)胞本身負(fù)責(zé)清除凋亡細(xì)胞并調(diào)節(jié)自身生理性正常凋亡，而SLE患者體內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬功能異常，以及自身免疫疾病中巨噬細(xì)胞的自身凋亡調(diào)控功能同樣顯示異常，這暗示巨噬細(xì)胞自身異常凋亡可能與SLE密切相關(guān)。

董曉薇[9]等研究表明，SLE患者血清中靶抗原Ro52蛋白表達(dá)水平顯著升高，這可能與SLE患者心血管疾病加劇并伴有單核-巨噬細(xì)胞異常凋亡增加，以及細(xì)胞炎癥因子分泌增加有關(guān)。Ro52蛋白是SLE等多種自身免疫性疾病過程中的主要靶點[6-8]，可能在調(diào)節(jié)凋亡和炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色[21]。對SLE心臟受累患者的研究中發(fā)現(xiàn)，抗Ro52抗體與胎兒凋亡的心肌細(xì)胞表面Ro52抗原結(jié)合后激活巨噬細(xì)胞[22]。同時發(fā)現(xiàn)，Ro52在細(xì)胞內(nèi)免疫過程中發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用[10]。BLAKE等[10]研究發(fā)現(xiàn)，石棉暴露導(dǎo)致的自身免疫疾病可促進巨噬細(xì)胞凋亡，并且凋亡的巨噬細(xì)胞表面Ro52表達(dá)上調(diào)。本研究明確Ro52可以調(diào)控單核-巨噬細(xì)胞的凋亡及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13的分泌。結(jié)果表明，Ro52作為重要的前凋亡分子在自身免疫疾病的巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)過程中起促進作用，而且很有可能是SLE免疫調(diào)控的一個重要途徑。

3.2 EGCG減緩Ro52對單核-巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥因子水平的調(diào)控

EGCG是一種綠茶多酚類分子[3，23]，被稱為自身免疫性疾病的潛在治療武器，已經(jīng)在治療干燥綜合癥等疾病、增強免疫系統(tǒng)功能與抑制腫瘤發(fā)生等領(lǐng)域中有深入研究[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠在20和50 mg/L 2個濃度顯著減緩Ro52過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞導(dǎo)致的Ro52超高表達(dá)，并且可以阻止THP-1細(xì)胞被Ro52過表達(dá)后導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增加。與pCMV-Ro52組相比，細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13水平被EGCG抑制。結(jié)果表明，EGCG是一種有效的抗凋亡和抗炎分子，可以減緩阻斷Ro52的促細(xì)胞凋亡效應(yīng)和促炎癥因子效應(yīng)。

以往研究同樣發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠有效抑制巨噬細(xì)胞凋亡，減輕免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[11，13]。HASHIMOTO等[25]研究發(fā)現(xiàn)，抑制EGCG可明顯誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)EGCG對Ro52具有明顯的抑制效應(yīng)[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG顯著抑制Ro52誘發(fā)的THP-1細(xì)胞凋亡，與上述結(jié)果一致。HSU等[14]在研究正常人原發(fā)性表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與永生化人涎腺腺泡細(xì)胞功能時發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠顯著抑制Ro52等多種自身抗原的表達(dá)。結(jié)果表明，Ro52可被EGCG負(fù)向調(diào)控，并且EGCG可通過抑制Ro52，介導(dǎo)人單核-巨噬細(xì)胞的凋亡與炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Ro52過表達(dá)可促進人單核-巨噬細(xì)胞THP-1的凋亡與炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13的分泌。EGCG可減弱Ro52介導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡，減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13的分泌。本實驗為進一步研究SLE等自身免疫疾病中巨噬細(xì)胞的功能、SLE的預(yù)防與治療，以及SLE的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。