陳 陽，孫華山，金一鋒，金忠民，陳雅君

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 抗性 基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

氮素是決定草坪草生長發(fā)育的重要因素，直接影響著草坪草的生長情況及觀賞價值[1-3]。植物氮素利用效率影響著草坪草的生長，草坪草缺氮植株多呈現(xiàn)黃化、低矮、抗逆能力低等特征[4]。草地早熟禾由于其抗寒、葉色濃綠、分蘗性強、成坪快等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于我國北方城市園林建設(shè)中[5-6]。目前，針對草地早熟禾(Poapratensis)氮素利用的研究主要集中氮素對于生理生化、坪用質(zhì)量、內(nèi)源激素含量、病害等影響[7-10]。在植物生長發(fā)育過程中，營養(yǎng)元素的多少直接影響到植物的形態(tài)建成，氮素為植物體內(nèi)重要元素，對于大部分植物而言，氮素影響其生長發(fā)育，但是，對草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)如何適應(yīng)氮素調(diào)控的變化仍然知之甚少。氮素、碳素為植物體內(nèi)重要元素，碳氮化合物參與植物一系列生命活動，碳代謝與氮代謝關(guān)系密切，相互提供能量與還原力等[11-15]。植物體內(nèi)C、N含量以及C/N是反映植物碳氮平衡的一項重要生理指標(biāo)。

試驗采用石蠟切片技術(shù)觀察氮脅迫后的草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)特點，探究解剖結(jié)構(gòu)與氮素相適應(yīng)的關(guān)聯(lián)；觀察氮脅迫下，不同組織中的總C、總N含量，探究氮素調(diào)控對于碳氮代謝的影響，綜合分析氮素不同濃度對草地早熟禾組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料來源與培育

供試材料為生長兩年的黑龍江野生草地早熟禾，將其于含高氮(15 mmol/L)、中氮(CK 7.5 mmol/L)、低氮(1.5 mmol/L)3種不同氮濃度的霍格蘭德培養(yǎng)液中培養(yǎng)2個月，NaNO3控制氮素含量，每隔3 d要更換1次營養(yǎng)液以保證養(yǎng)分的正常供應(yīng)。每個濃度重復(fù)5次，取樣后保存。

1.2 解剖結(jié)構(gòu)的觀察與測定

選取草地早熟禾不同組織部位進(jìn)行石蠟切片的制作，試驗參照已經(jīng)優(yōu)化的草地早熟禾石蠟切片制作過程進(jìn)行。采用50%乙醇+冰醋酸+40%甲醛的FAA固定劑對其固定24 h。采用乙醇逐級梯度脫水后再用無水乙醇脫水5次。采用逐級過渡的方法將材料從純乙醇中逐漸過渡到純二甲苯，純二甲苯更換3次，每次0.8 h。將試驗材料浸蠟24 h，期間更換5次純蠟。將材料進(jìn)行包埋、切片、展片及貼片一系列操作。試驗采用番紅-固綠染色法，其中，番紅溶液3 h、固綠溶液40 s。石蠟切片制作好后，采用生物光學(xué)顯微鏡40×觀察，Motic Images Advanced 3.2顯微鏡圖像分析軟件(廈門麥克奧迪生產(chǎn))進(jìn)行測量、記錄、拍攝植物各典型結(jié)構(gòu)解剖圖，再進(jìn)一步探究不同氮濃度對植株各結(jié)構(gòu)的影響。

1.3 氮素調(diào)控對草地早熟禾組織中全碳、全氮含量的測定

選取草地早熟禾不同濃度氮素后組織樣本，105℃烘干15 min，并在65℃烘干6～8 h至恒質(zhì)量，制成粉末。采用PerkinElmer 2400-CHNS/O元素分析儀進(jìn)行測定，測得全C與全N的含量，每個處理測定3個樣本。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

采用SPSS 22.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，分別對同一部位不同氮素處理進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素調(diào)控對葉的解剖結(jié)構(gòu)的影響

草地早熟禾葉解剖結(jié)構(gòu)包括表皮、維管束、厚壁組織、氣腔、葉肉組織。從解剖結(jié)構(gòu)上看到，表皮由長圓形排列更為緊密的單層細(xì)胞組成，維管束均勻分布排列，厚壁組織較明顯，氣孔密集分布于表皮中。對于葉橫剖面中的表皮、厚壁組織、氣腔、維管束來說，高氮組各組數(shù)據(jù)均高于中氮組(CK組)、低氮組，即高氮組>中氮組>低氮組。但是高氮組與中氮組(CK組)、低氮組之間存在顯著差異(P<0.05)，中氮組與低氮組之間不存在顯著差異。通過表1可以觀察到，氮可以促進(jìn)植株葉解剖結(jié)構(gòu)的生長發(fā)育且在一定范圍內(nèi)氮濃度越高生長勢越好。但高濃度的氮素比低濃度氮素對植物的影響更大，低濃度氮素雖然對植株的生長有一定影響但和正常氮素處理組下無顯著差異。

圖1 草地早熟禾葉的解剖結(jié)構(gòu)Fig.1 Anatomical structure of leaves of Kentucky bluegrass注：1.表皮；2.維管束；3.厚壁組織；4.氣腔.

典型結(jié)構(gòu)高氮中氮(CK) 低氮表皮厚度/μm37.69±1.01a26.81±3.08b25.08±1.88b厚壁組織長度/μm87.82±5.55a60.03±4.57b52.16±2.51b氣腔面積/μm217 820.06±2 272.22a12 418.90±989.09b11 924.19±759.19b維管束面積/μm219 125.39±899.93a12 059.53±961.01b10 845.08±1 695.95b

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，樣本數(shù)量=3，同行不同小寫字母表示差異著性(P<0.05)

2.2 氮素調(diào)控對莖的解剖結(jié)構(gòu)的影響

選定草地早熟禾莖的表皮厚度、厚壁組織長度、氣腔面積、維管束面積4項指標(biāo)對草地早熟禾不同氮處理后的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和測定，可以看到，草地早熟禾莖部解剖結(jié)構(gòu)包括表皮、維管束、厚壁組織、氣腔、 氣孔、葉肉組織(圖2)。莖頂端部分組成較簡單，最外層的氣腔所占面積較大。對莖部橫剖面中的表皮厚度進(jìn)行比較得出，高氮組>中氮組(CK組)>低氮組，并且3組之間存在顯著差異(P<0.05)，對于莖頂端橫剖面中的厚壁組織長度、氣腔面積進(jìn)行比較，高氮組>中氮組>低氮組，但高氮組與中氮組(CK組)、低氮組之間存在顯著差異(P<0.05)，中氮組與低氮組之間無顯著差異。對于莖頂端橫剖面中的維管束來說,高氮組>中氮組>低氮組，但高氮組與中氮組之間不存在顯著差異，其高氮組與低氮組存在顯著差異(表2)。

圖2 草地早熟禾莖解剖結(jié)構(gòu)Fig.2 The anatomical structure of the stem of Kentucky Bluegrass注：1.表皮；2.維管束；3.厚壁組織；4.氣腔

2.3 氮素調(diào)控對根頸的解剖結(jié)構(gòu)的影響

從草地早熟禾根頸的解剖結(jié)構(gòu)組成中可以看到(圖3)，其排列統(tǒng)一的表皮結(jié)構(gòu)，維管束精密排列成一圈，中間為髓腔。其中，維管束生長完全，由韌皮部、氣隙、環(huán)紋導(dǎo)孔、篩管、木質(zhì)部組成。對于不同氮素處理后的草地早熟禾根頸橫剖面中的表皮厚度、厚壁組織長度、同化組織長度、維管束面積4項數(shù)據(jù)比較分析得到，高氮組>中氮組(CK組)>低氮組，高氮組與中、低氮組之間存在顯著差異(P<0.05)(表3)。

圖3 草地早熟禾根頸的解剖結(jié)構(gòu)Fig.3 The anatomical structure of rhizome of Kentucky Bluegrass注：1.表皮；2.同化組織；3.維管束；4.薄壁組織；5.厚壁組織

典型結(jié)構(gòu)高氮中氮(CK) 低氮表皮厚度/μm48.90±2.18a40.91±1.37b29.66±1.53c厚壁組織長度/μm60.75±4.98a45.66±2.24b36.70±3.91b氣腔面積/μm248 728.10±1 329.47a31 660.89±3 120.87b28 097.96±2 960.68b維管束面積/μm217 783.56±1 386.49a14 471.43±1 204.66ab11 465.04±716.48b

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 氮素調(diào)控對草地早熟禾組織中全碳、全氮的含量及C/N的影響

在不同濃度的氮處理下，草地早熟禾組織部位的總氮含量均呈葉部最多，根頸部位最少的特征。3個部位的總氮含量隨著氮素濃度的降低而減少，其中葉部變化明顯(圖4)。在高氮、中氮處理下，不同部位的總碳含量為，根頸>葉>莖；但在低氮處理后總碳含量為，葉>莖>根頸(圖5)。3個部位的總碳含量均隨著氮素濃度的降低而減少。氮脅迫下草地早熟禾不同組織部位的C/N為根頸>莖>葉，在高氮、中氮處理下，葉、莖的C/N變化不大，但根頸的C/N隨著氮濃度的降低而升高(圖6)。

表3 不同氮處理后草地早熟禾根頸橫切面各結(jié)構(gòu)的差異分析

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

圖4 氮脅迫下草地早熟禾不同組織 部位的總氮含量Fig.4 Total nitrogen content in different tissue parts of Kentucky Bluegrass under nitrogen stress

圖5 氮脅迫下草地早熟禾不同組織 部位的總碳含量Fig.5 Total carbon content in different tissue parts of Poa pratensis under nitrogen stress

3 討論

氮素是植物的生命元素，作為肥料的三要素之一，被廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)作物和園林植物的栽培中。當(dāng)有足夠的氮素時，植物體內(nèi)能產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)，促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂、分化和同化物的積累，使植物的葉片面積、凈光合速率增大[16-17]。當(dāng)?shù)夭蛔銜r，植株弱小，葉色發(fā)黃，生長速率變慢，增施氮肥后可明顯提高植物生長發(fā)育水平。碳氮平衡影響植物營養(yǎng)生長與生殖生長，碳、氮含量及C/N的變化作為觀察碳氮同化過程的重要指標(biāo)之一。有研究者發(fā)現(xiàn)氮素調(diào)控對紫花苜蓿幼苗根系解剖結(jié)構(gòu)有一定影響，施氮可顯著促進(jìn)其維管束的生長發(fā)育[18]，氮素調(diào)控草地早熟禾生長中，根頸部位隨著氮素濃度增加有利于維管束的生長。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根頸部位的總C含量隨著氮濃度的增加隨之提高，這可能是由于充足的氮源有助于碳氮代謝過程，并且將光合產(chǎn)物源源不斷的通過韌皮部運輸?shù)礁i部，進(jìn)一步促進(jìn)根頸解剖結(jié)構(gòu)中維管束、厚壁組織的生長。葉、莖、根頸3個部位的表皮、厚壁組織、維管束面積在高濃度氮素營養(yǎng)培養(yǎng)下，其數(shù)值均明顯大于中氮、低氮培養(yǎng)，高濃度氮培養(yǎng)下可能有利于草地早熟禾的解剖結(jié)構(gòu)的生長，這與紫花苜蓿、玉米、水稻等[19]充足的氮源有利于植物的生長的結(jié)果相似。研究不僅限于單一觀察氮素調(diào)控對于草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)的影響，通過結(jié)合碳氮含量的測定，觀察氮素充足時解剖結(jié)構(gòu)的變化與碳氮平衡之間的關(guān)聯(lián)，當(dāng)?shù)馗邼舛裙┙o時，有利于碳水化合物的合成，總C含量較高，草地早熟禾高氮組的解剖結(jié)構(gòu)生長由于低氮組，但C/N隨著氮濃度增加反而降低，這表明在低的氮素養(yǎng)分條件下，植物的生長雖然緩慢，但氮素養(yǎng)分利用效率較好，具有高的C/N，這與藏北高寒草地植物碳氮特征[20-21]的研究結(jié)果一致。因此，多角度了解草地早熟禾植株生長、C∶N化學(xué)計量特征與外界氮素環(huán)境因素的影響，為進(jìn)一步探究草地早熟禾如何高效利用氮素奠定基礎(chǔ)。

圖6 氮脅迫下草地早熟禾不同組織部位的C/NFig.6 C/N ratio of different tissue parts of Kentucky Bluegrass under nitrogen stress

4 結(jié)論

充足的氮素有利于草地早熟禾解剖結(jié)構(gòu)的生長發(fā)育，高濃度氮素調(diào)控下的葉、莖、根頸中的表皮厚度、厚壁組織長度、氣腔面積、維管束面積等指標(biāo)均大于中氮、低氮組。草地早熟禾3個部位的總氮、總碳含量隨著氮素濃度的增加而增多，相同氮素調(diào)控下，草地早熟禾不同部位的C/N為，根頸>莖>葉。