涂志剛，崔 婧，嚴(yán)耿杰，駱麗珍，李丹萍，周永燦，邱名毅

( 1.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 海口 571126; 2.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 海口 570228 )

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)，屬鱸形目、鲹科、鯧鲹亞科、鯧鲹屬，俗稱金鯧魚、黃臘鯧，是一種暖水性中上層魚類，在我國東海、南海和黃海均有分布[1]，為我國廣東、廣西、海南以及臺灣等沿海省市深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種之一[2-5]。據(jù)農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局和全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站統(tǒng)計，2015年海南省僅深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹產(chǎn)量已達(dá)3.5×104t，占全省海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量的45%。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度提高，卵形鯧鲹養(yǎng)殖受細(xì)菌性病原和寄生蟲病原影響越來越嚴(yán)重，特別是刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)病爆發(fā)后，繼發(fā)細(xì)菌性感染對卵形鯧鲹深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖造成了巨大損失。據(jù)保守統(tǒng)計，2016年由于這兩種疾病的影響，全國網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹經(jīng)濟(jì)損失約達(dá)5億元，已經(jīng)成為除臺風(fēng)外，制約我國深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖持續(xù)健康發(fā)展的關(guān)鍵因素。

近年來，海南省網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹陸續(xù)出現(xiàn)“爛身病”的疾病。據(jù)調(diào)查，該病在海南省網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病率較高，且持續(xù)時間長，每年5—10月均有記錄。主要癥狀表現(xiàn)為身體、背鰭、吻端或眼部有潰爛，獨(dú)游、活力較差、反應(yīng)遲鈍，體表黏液多，背鰭發(fā)黑；解剖發(fā)現(xiàn)，魚體腹部常伴有積水，肛門發(fā)紅、腫脹，肝臟呈灰白。為查明該病發(fā)生的原因，于2016年5月份對海南臨高后水灣和澄邁橋頭深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)的卵形鯧鲹“爛身病”進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查，在病原菌分離鑒定的基礎(chǔ)上利用藥敏紙片法對病原菌進(jìn)行藥敏分析，旨在為海南后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)卵形鯧鲹“爛身病”防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)魚類

于2016年5月自海南臨高后水灣和澄邁橋頭深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)采集到具有典型“爛身病”癥狀的瀕死卵形鯧鲹，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行疾病常規(guī)檢查并進(jìn)行細(xì)菌分離(圖1)。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

病原菌株分離于患“爛身病”卵形鯧鲹，經(jīng)鑒定后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

試驗(yàn)用培養(yǎng)基分別為2216E普通海水培養(yǎng)基(pH 7.6～7.8)和硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基。

1.3 病原菌的分離與半致死密度的測定

1.3.1 病原菌的分離

無菌操作從病魚的病灶體表潰瘍處、肝臟、腎臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離，接種于2216E普通海水培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)菌落形態(tài)選擇優(yōu)勢菌挑取單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 健康卵形鯧鲹(左)和患有“爛身病”卵形鯧鲹(右)

1.3.2 人工感染

自患病卵形鯧鲹分離的菌株分別用2216E普通海水培養(yǎng)基30 ℃搖床培養(yǎng)16～18 h，6000 r/min離心5 min，棄上清液，加入無菌生理鹽水，制成1.47×108cfu/mL的菌懸液，腹腔注射10尾卵形鯧鲹，注射量為0.2 mL/尾，設(shè)置3個重復(fù)組。對照組腹腔注射等量無菌生理鹽水。置于(30±1) ℃圓形桶中充氣養(yǎng)殖，連續(xù)觀察7 d，記錄各組試驗(yàn)魚活動情況、患病情況及死亡數(shù)，并從具有典型“爛身病”的試驗(yàn)魚肝臟等組織再次進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.3.3 半致死密度的測定

用無菌生理鹽水對1.47×108cfu/mL的菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋，以0～10-3稀釋度的菌懸液分別腹部注射，對照組注射等量無菌生理鹽水。每組設(shè)置3個重復(fù)組，置于水族箱中飼養(yǎng)。連續(xù)觀察7 d并記錄這組試驗(yàn)魚的活動情況與死亡數(shù)，用Reed-Muench 法計算半數(shù)致死密度[6]，將單位質(zhì)量半致死密度低于106cfu/(mL·g)菌株確定為強(qiáng)毒株。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征

將純化的菌株劃線接種于硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落特征。同時進(jìn)行革蘭氏染色和電鏡負(fù)染，觀察菌體形態(tài)特征，其他各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測定參照文獻(xiàn)[7]描述的方法進(jìn)行。

1.5 16S rRNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擴(kuò)增16S rDNA的正向引物為P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物為Pr：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′[8]。在25 μL的PCR反應(yīng)體系中含有10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Taq E聚合酶0.2 μL，引物P1和引物Pr各1 μL，模板1 μL，無菌水17.3 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；最后72 ℃溫育10 min，4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。

將分離菌株16S rRNA基因序列與自美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中獲得的其同屬細(xì)菌的16S rRNA基因序列一起，運(yùn)用Mega軟件進(jìn)行序列排比，生成mas格式文件。通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。采用鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 分離菌株藥敏特征檢測

藥敏試驗(yàn)參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片法進(jìn)行。分離菌株接種2216E普通海水液體培養(yǎng)基，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，配制密度為1.47×108cfu/mL的菌懸液，將菌液(0.1 mL/皿)均勻涂布于2216E普通海水固體培養(yǎng)基，按操作要求貼上藥敏紙片，每種紙片共3個重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，并根據(jù)同一藥敏紙片3個重復(fù)組的平均值判定該藥物對菌株的敏感性。

2 結(jié)果和分析

2.1 病原菌分離與人工感染

自患病卵形鯧鲹肝臟中共分離到1株優(yōu)勢菌株QT520，以1.47×108cfu/mL的菌液腹腔注射感染健康卵形鯧鲹，導(dǎo)致感染魚100%死亡(表1)。人工感染后，病魚表現(xiàn)活力差、反應(yīng)遲鈍，體表黏液增多，背鰭發(fā)黑，腹部積水，肛門紅腫以及肝臟呈灰白等癥狀，后期表現(xiàn)為體表潰爛，與采集到的患有“爛身病”卵形鯧鲹癥狀相似。

采用寇氏法測定該菌株對卵形鯧鲹的半致死密度為4.2×106cfu/mL，試驗(yàn)魚的體質(zhì)量為(17±1) g/尾，折合單位質(zhì)量的半致死密度為2.5×105cfu/(mL·g)。

表1 菌株QT520的人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌落形態(tài)及生理生化特征

菌株QT520在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)基上生長良好，30 ℃培養(yǎng)24 h，菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，中央稍隆起；革蘭氏染色陰性，短桿狀，稍彎曲；電鏡負(fù)染顯示極生單鞭毛(圖2)。生理生化檢測結(jié)果表明，該菌株能在35 ℃生長，氧化酶和接觸酶均為陽性，能利用葡萄糖、檸檬酸鈉，不能利用甘露醇、肌醇、山梨糖及蔗糖；精氨酸雙水解酶呈陰性；硝酸鹽(還原)呈陽性(表2)。該菌株與哈維弧菌(Vibrioharveyi)參考菌株ATCC14126相比，除不能利用甘露醇，賴氨酸脫羧酶以及鳥氨酸脫羧酶以及吲哚試驗(yàn)均為陰性外，其他結(jié)果一致。

圖2 菌株QT520革蘭氏染色(a)及電鏡負(fù)染圖片(b)

鑒定項(xiàng)目菌株QT520哈維弧菌ATCC14126鑒定項(xiàng)目菌株QT520哈維弧菌ATCC141264 ℃生長--蜜二糖--30 ℃生長++Kohn明膠++35 ℃生長++賴氨酸脫羧酶-+40 ℃生長--鳥氨酸脫羧酶-+革蘭氏染色--脲素酶--運(yùn)動性++色氨酸脫氨酶--培養(yǎng)基生長顏色黃色黃色葡萄糖++0% NaCl生長--甘露醇-+3% NaCl生長++肌醇--6% NaCl生長++山梨醇--8% NaCl生長++蔗糖--10% NaCl生長--硝酸鹽(還原)++氧化酶++吲哚試驗(yàn)-+接觸酶++O/129(10 μg)--發(fā)光--O/129(150 μg)++精氨酸雙水解酶--阿拉伯糖--梓檬酸鈉++

注：+：反應(yīng)陽性；-：反應(yīng)陰性.

2.3 16S rRNA系統(tǒng)樹分析

16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果(圖3)表明，菌株QT520與哈維弧菌聚為一支，表明菌株QT520與哈維弧菌親緣關(guān)系最近。經(jīng)16S rRNA基因序列比對進(jìn)一步證實(shí)，菌株QT520與哈維弧菌菌株同源性達(dá)到99.9%。因此，綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及測序結(jié)果，確定菌株QT520為哈維弧菌。

2.4 藥敏特征

哈維弧菌QT520對18種抗生素的敏感性結(jié)果見表3，該菌株對多西環(huán)素、利福平、先鋒哌酮、頭孢吡肟、派拉西林、頭孢曲松、頭孢哌酮和慶大霉素均敏感，但對四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定和頭孢克肟表現(xiàn)為耐藥。

藥物名稱藥量μg/片抑菌圈直徑mm敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)(R,I,S)mm多西環(huán)素3025S≤12,13～15,≥16利福平525S≤16,17～19,≥20先鋒哌酮(舒巴坦)7528S≤15,16～20,≥21頭孢吡肟3024S≤14,15～17,≥18頭孢噻肟3020I≤14,15～22,≥23頭孢氨芐3010R≤14,15～17,≥18哌拉西林19925S≤17,18～20,≥21卡那霉素300R≤13,14～17,≥18鏈霉素106R≤11,12～14,≥15頭孢曲松3030S≤13,15～21,≥22頭孢唑啉3015I≤14,15～17,≥18頭孢拉定3010R≤14,15～17,≥18頭孢克肟510R≤15,16～18,≥19恩諾沙星525S≤16,17～22,≥23新霉素3017I≤16,17～23,≥24頭孢哌酮7525S≤15,16～20,≥21四環(huán)素3013R≤14,15～18,≥19復(fù)方新諾明017I<10,10～19,>19慶大霉素1015S≤12,13～14,≥15

注：R表示耐藥，I表示中介，S表示敏感.

3 討 論

卵形鯧鲹為近年來海南、廣東和廣西等地深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要品種，相關(guān)病害研究較少，早期周永燦等[9]對海南省卵形鯧鲹大面積死亡原因進(jìn)行了調(diào)查，分離到一株嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia)；王瑞旋等[10]在陵水調(diào)查分離到了一株卵形鯧鲹致病菌——美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacteriumdamselaessp.piscicida)；黃婷等[11]報道了廣西網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹感染海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)和無乳鏈球菌(S.agalactiae)的病例。然而隨著深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷加大，養(yǎng)殖的病害也日趨嚴(yán)重，其中由細(xì)菌引起的“爛身病”已成為海南后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖的卵形鯧鲹主要病害類型之一。據(jù)監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，該病的發(fā)病高峰期為每年的3—5月和8—11月，此時養(yǎng)殖水域平均溫度25～30 ℃，與弧菌爆發(fā)的高峰期吻合[12]。每年進(jìn)入8—11月，養(yǎng)殖卵形鯧鲹的攝食和代謝等活動旺盛，會引起養(yǎng)殖水體中殘餌和糞便增多，加上高密度養(yǎng)殖使網(wǎng)箱內(nèi)外水體交換能力下降，從而有利于病原菌的滋生。對該季節(jié)后水灣深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)弧菌總數(shù)分析表明，養(yǎng)殖網(wǎng)箱內(nèi)弧菌密度達(dá)3.5×103cfu/mL，是網(wǎng)箱外及非養(yǎng)殖的外海對照區(qū)的50倍和1000倍[12]，這可能為深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖卵形鯧鲹疾病爆發(fā)的主要誘因。

本試驗(yàn)從患有“爛身病”卵形鯧鲹肝臟中分離到一株優(yōu)勢菌株QT520，經(jīng)回歸感染試驗(yàn)確定其為病原菌。菌株QT520在形態(tài)學(xué)和生理生態(tài)特征方面與哈維弧菌參考菌株最為接近。通過16S rRNA基因序列比對進(jìn)一步證實(shí)，菌株QT520與哈維弧菌菌株同源性達(dá)99.9%。綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及測序結(jié)果，確定菌株QT520為哈維弧菌。哈維弧菌QT520對卵形鯧鲹的單位質(zhì)量半致死密度為2.5×105cfu/(mL·g)，屬于強(qiáng)毒菌株。已有研究表明，哈維弧菌對石斑魚(Epinephelus)、高體(Serioladumerili)和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)均有較強(qiáng)的致病力[13-18]。陳獻(xiàn)稿等[15]分離到的哈維弧菌EcGY020401對斜帶石斑魚(E.coioides)的半致死劑量達(dá)2.7×106cfu/g，梅冰等[14]分離到的哈維弧菌HS08001對斜帶石斑魚的半致死劑量達(dá)1.05×104cfu/g；徐先棟[19]研究了46株哈維弧菌對斜帶石斑魚攻毒的毒性，其中有18株菌株屬于強(qiáng)毒株。

養(yǎng)殖過程中不合理使用抗生素，如誤用、濫用抗生素均會提高水體中病原菌的耐藥性。不同時間、不同養(yǎng)殖場分離到的哈維弧菌對同一種藥物的敏感性差異較大。已有研究表明，哈維弧菌HS08001菌株僅對慶大霉素、氯霉素和利福平3種藥物高度敏感，對鏈霉素、卡那霉素和青霉素等18種抗菌藥物不敏感[14]；哈維弧菌EcGY020401對利福平、四環(huán)素、喹諾酮類及頭孢曲松等抗生素較為敏感[15]。本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，哈維弧菌QT520株與HS08001株、EcGY020401株有一定的差異，對利福平、慶大霉素和多西環(huán)素等9種藥物敏感，對四環(huán)素、鏈霉素和卡拉霉素等6種藥物具有耐藥性。因此，在實(shí)際養(yǎng)殖過程中可以參考使用利福平和慶大霉素等敏感性藥物來防治該病害。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)自海南省深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患爛身病的卵形鯧鲹中分離到1株優(yōu)勢菌株QT520，經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及16S rRNA基因序列比對，將該菌株確定為哈維弧菌。人工感染試驗(yàn)表明，哈維弧菌QT520對卵形鯧鲹的單位質(zhì)量半致死密度為2.5×105cfu/(mL·g)，屬于強(qiáng)毒株型。藥敏分析結(jié)果顯示，哈維弧菌QT520對利福平、慶大霉素和多西環(huán)素等9種藥物敏感，而對四環(huán)素、鏈霉素和卡那霉素等6種藥物耐藥。