閆小飛，張富軍，杜小娟，武麗濤，李冬民，韓 燕

(西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，西安 710061)

骨質(zhì)疏松癥是由多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降、骨超微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而易發(fā)生骨折的全身性骨病。目前，全球約有2億人患有骨質(zhì)疏松癥[1-2]。在骨中，成骨細胞負(fù)責(zé)骨質(zhì)形成，破骨細胞參與骨質(zhì)吸收。骨形成減少、骨吸收增加或不變，導(dǎo)致骨質(zhì)凈流失均會造成骨質(zhì)疏松[3]。增強成骨細胞活性與分化，促進骨質(zhì)生成，是有效預(yù)防骨質(zhì)疏松的方法之一。

丹參是著名的傳統(tǒng)中藥，具有抗氧化、改善微循環(huán)和防止血栓形成等多種功能[4-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹參可促進骨愈合，預(yù)防股骨頭壞死，有效降低絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松相關(guān)生化指標(biāo)[7-8]。目前，已知丹參中含有丹參素、丹酚酸A和丹酚酸B等多種單體成分。丹參素(β-3，4-dihydroxyphenyl-lactic acid)是中藥丹參主要的水溶性提取物之一[9]。丹參素單體在成骨細胞發(fā)育中的作用及機制還不清楚。本研究通過觀察丹參素對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞分化的影響，為闡明丹參素是否具有調(diào)節(jié)骨生成和防治骨質(zhì)疏松提供實驗證據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 Millipore Elix 純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司)；Eppendorf AG 22331 Hamburg高速離心機(德國Eppendorf公司)；Mx3000P/3005P實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫公司)；SYNGENE G:BOX F3凝膠成像分析系統(tǒng)(英國SYNGENE公司)；TECAN Infinite?M1000 Pro全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；Nikon DS-Ri1-U3 數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)(日本Nikon公司)。

1.2試藥 丹參素(相對分子質(zhì)量為198.17，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，購自陜西易飛生物科技有限公司；Wnt/β-catenin抑制劑KYA1797K，分析純，購自美國Selleck公司。

1.3材料 膠原酶Ⅳ和alpha-MEM培養(yǎng)基，購自美國GIBCO公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素/鏈霉素和胰酶，購自美國Hyclone公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色試劑和茜素紅染色試劑，購自南京建成生物工程研究所；iScriptTM cDNA 合成試劑盒，實時定量熒光PCR試劑盒，均購自美國Thermo公司。

2 方法

2.1大鼠原代成骨細胞的獲取與培養(yǎng) 大鼠原代成骨細胞的獲取參照文獻[10]進行。選取2～4 d新出生的SD大鼠，用斷頭法處死，在無菌條件下取出顱骨，剔凈后剪成1 mm3的碎塊，用質(zhì)量濃度為2 g·L-1的膠原酶Ⅳ消化15 min以去除纖維細胞。將碎骨塊用質(zhì)量濃度為2 g·L-1的膠原酶Ⅳ消化45 min，收集成骨細胞。加入含100 mL·L-1血清的a-MEM培養(yǎng)液，放入37 ℃、50 mL·L-1的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)靜置培養(yǎng)。此后每間隔3 d換液1次，待細胞生長至培養(yǎng)瓶底80%時，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，按照1∶2傳代培養(yǎng)。取第3～10代的細胞進行實驗。在誘導(dǎo)細胞分化時，在細胞培養(yǎng)液中另外添加質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的抗壞血酸和5 mmol·L-1的β-甘油磷酸鈉[11]。

2.2細胞毒性實驗 以4×103個·孔-1的細胞密度將原代成骨細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。次日分別加入0，0.1，1和10 μmol·L-1的丹參素，分別于藥物作用24，48，72和96 h后，在各細胞培養(yǎng)孔中分別加入20 μL MTT溶液(質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1)繼續(xù)孵育4 h后，吸去孔內(nèi)液體，再加入150 μL DMSO,振蕩10 min，在490 nm波長處測定各孔的光密度(optical density，A)值。

2.3Real-time PCR 參照RNA提取試劑盒說明書提取RNA，將提取到的總RNA用分光光度計定量。測定RNA的濃度后取1 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。運用real-time PCR檢測成骨細胞分化標(biāo)志基因Runx2和Osterix mRNA的表達，選擇GAPDH作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)采用ΔΔCT法進行分析，為3次重復(fù)實驗的平均值。用到的引物序列如下。Osterix上游引物序列：5′-GGAAAGGAGGCACAAAGAAGC-3′，下游引物序列：5′-CCCCTTAGGCACTAGGAGC-3′。Runx2上游引物序列：5′-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3，下游引物序列5′-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3′。GAPDH上游引物序列：5′-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3′，下游引物序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′。

2.4ALP染色 將大鼠成骨細胞以5×104個·孔-1的密度接種于24孔板中，待細胞生長至細胞培養(yǎng)孔底80%后，更換培養(yǎng)基對細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，7 d后棄上清液，用PBS緩沖液沖洗2遍，乙醇固定30 min后用PBS緩沖液沖洗2遍，加入按照試劑盒要求配制的染液染色10 min，蒸餾水沖洗2遍后鏡下觀察成像。

2.5鈣化結(jié)節(jié)染色 將大鼠成骨細胞以5×104個·孔-1的密度接種于24孔板中，待細胞生長至細胞培養(yǎng)孔底80%后，更換培養(yǎng)基對細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，20 d后去除細胞培養(yǎng)上清液，用PBS緩沖液沖洗細胞2遍，乙醇固定30 min后用PBS緩沖液沖洗2遍，加入質(zhì)量濃度為2 g·L-1的茜素紅染液(pH值為8.4)，37 ℃染色30 min，蒸餾水沖洗2遍后顯微鏡下觀察成像。

2.6Western Blotting檢測蛋白表達 用Western Blotting檢測細胞核內(nèi)β-catenin含量時，按照碧云天細胞核提取試劑盒方法提取核蛋白。取20 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1的脫脂奶粉封閉，4 ℃特異性單克隆抗體孵育過夜，再用HPR標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，以上各步驟間用TBST洗膜5 min。增強ECL顯影液顯影。用Image J分析軟件測定圖像條帶灰度值，計算蛋白相對含量。

2.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1丹參素對原代成骨細胞的增殖活性無影響 通過MTT法檢測丹參素對原代成骨細胞增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0，0.1，1和10 μmol·L-1的丹參素對原代成骨細胞增殖活性均無影響，見圖1。

圖1不同濃度的丹參素對大鼠成骨細胞增殖的影響

Fig.1 Effect of different concentration of tanshinol on rat osteoblastic cell proliferation

3.2丹參素提高原代成骨細胞分化基因Runx2和Osterix的mRNA表達 原代成骨細胞在不同條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用Real-time PCR檢測成骨細胞分化基因Runx2和Osterix的mRNA表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與丹參素未處理的細胞相比，在1和10 μmol·L-1丹參素處理的成骨細胞中Runx2和Osterix的mRNA表達明顯升高(P<0.05)；然而0.1 μmol·L-1丹參素處理的成骨細胞中Runx2和Osterix的 mRNA無明顯改變。見圖2。

3.3丹參素增強原代成骨細胞ALP的活性 ALP是成骨細胞分化的標(biāo)志物。ALP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1和10 μmol·L-1丹參素處理組細胞質(zhì)藍染較深且陽性部位較多。結(jié)果表明，1和10 μmol·L-1丹參素處理組細胞ALP染色強度均明顯高于丹參素未處理組，見圖3。提示ALP的活性隨丹參素濃度的升高而增強。

3.4丹參素促進成骨細胞鈣化 細胞培養(yǎng)21 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，丹參素未處理組細胞未見鈣化結(jié)節(jié)形成。而1和10 μmol·L-1丹參素處理組成骨細胞可見大量礦化結(jié)節(jié)，見圖3。研究結(jié)果表明，一定濃度的丹參素能夠促進成骨細胞分化并形成鈣化結(jié)節(jié)。

圖2不同濃度丹參素對Runx2和OsteorixmRNA表達的影響

注：*P<0.05，**P<0.01。

Fig.2 Effect of different concentration of tanshinol on Runx2 and Osteorix mRNA expression

Note：*P<0.05，**P<0.01.

圖3成骨細胞染色結(jié)果

Ⅰ.ALP染色；Ⅱ.茜素紅染色。A.0 μmol·L-1丹參素處理組(×40)；B.0.1 μmol·L-1丹參素處理組(×40)；C.1 μmol·L-1丹參素處理組(×40)；D.10 μmol·L-1丹參素處理組(×40)。

Fig.3 Staining results of osteoblastic cell

Ⅰ.ALP staining；Ⅱ.ARS staining.A.0 μmol·L-1tanshinol-treated group (×40)；B.0.1 μmol·L-1tanshinol-treated group (×40)；C.1 μmol·L-1tanshinol-treated group (×40)；D.10 μmol·L-1tanshinol-treated group (×40).

3.5Wnt/β-catenin通路活化參與丹參素對成骨細胞的分化調(diào)控 文獻報道，Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成過程中具有重要作用[12]。β-catenin由胞漿移至核內(nèi)是這一信號通路活化的重要環(huán)節(jié)[13]。原代成骨細胞在不同條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，收集細胞，提取核蛋白。Western Blotting檢測結(jié)果顯示，1和10 μmol·L-1丹參素處理組成骨細胞β-catenin的核內(nèi)表達量明顯高于丹參素未處理組(P<0.05)，見圖4A和4B。KYA1797K是有效的、高度選擇性的Wnt/β-catenin抑制劑[14]。丹參素處理成骨細胞前10 min，在細胞培養(yǎng)基中加入KYA1797K (0.1 μmol·L-1)。分析KYA1797K聯(lián)合丹參素共同處理組和丹參素單獨處理組中成骨細胞分化基因Runx2的mRNA表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與丹參素單獨處理組相比，Runx2基因mRNA表達水平在KYA1797K聯(lián)合丹參素共同處理組細胞中明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明，Wnt/β-catenin通路參與丹參素對成骨細胞分化過程的調(diào)控，見圖4C。

圖4Wnt/β-catenin通路活化參與丹參素對成骨細胞的分化調(diào)控

A.β-catenin免疫印跡代表圖；B.β-catenin免疫印跡統(tǒng)計結(jié)果；C.不同處理條件下Runx2的mRNA表達。*P<0.05，

**P<0.01。

Fig.4 Activation of Wnt/β-catenin pathway was involved in the effect of tanshinol on osteoblastic cell differentiation

A.representative Western blotting ofβ-catenin；B.statistic result on Western blotting data ofβ-catenin；C.Runx2 mRNA expression on different culture condition.*P<0.05，**P<0.01.

4 討論

丹參是被廣泛應(yīng)用的一味中藥，具有抗氧化、改善微循環(huán)、防止血栓形成等多種功能[6，15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹參能夠促進骨愈合，對預(yù)防股骨頭壞死及治療骨質(zhì)疏松有很好的功效[7]。SD大鼠模型已證實丹參提取物能有效治療由糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥[8]。體外實驗也已證實丹參注射液能夠增強小鼠成骨細胞ALP的活性以及抑制小鼠破骨細胞的生成[16]。

丹參素是中藥丹參的主要水溶性提取物之一。崔燎等[8]在對比研究丹參提取物和丹參素對體外培養(yǎng)成骨細胞ALP活性的影響時發(fā)現(xiàn)，丹參提取物的作用與丹參素作用一致，因此推測丹參提取物的作用成分很可能就是丹參素[7，17]。在本研究中，我們用大鼠原代成骨細胞為模型，多指標(biāo)綜合觀察丹參素對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞分化的影響。Runx2和Osterix是成骨細胞早期分化的標(biāo)志性基因[18]。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，一定濃度的丹參素能夠促進Runx2和Osterix的 mRNA表達，說明丹參素具有促進成骨細胞早期分化的作用。ALP是促進骨間質(zhì)礦化的重要酶，能夠促進局部鈣、磷濃度升高，有助于骨的鈣化。ALP活性反映成骨細胞的分化狀態(tài)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參素能夠增強原代成骨細胞ALP的活性，且這種增強作用具有劑量依賴性，ALP活性隨丹參素濃度的升高而提高。鈣鹽沉積導(dǎo)致鈣化結(jié)節(jié)形成是成骨細胞分化至中晚期的主要指標(biāo)。在誘導(dǎo)分化3周后，我們用茜素紅染色法證實，丹參素能夠促進成骨細胞分化形成鈣化結(jié)節(jié)。成骨細胞分化是多因子、多通路參與的復(fù)雜過程。Wnt/β-catenin是調(diào)節(jié)成骨細胞分化及骨形成中的一條重要信號通路[12]。當(dāng)Wnt信號通路活化時，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin由胞漿轉(zhuǎn)運至胞核，進而調(diào)控下游成骨細胞分化基因轉(zhuǎn)錄和表達[13，20]。我們用Western Blotting實驗證實，丹參素處理組成骨細胞β-catenin的細胞核內(nèi)表達量明顯高于對照組，提示丹參素通過激活Wnt/β-catenin通路促進成骨細胞分化。應(yīng)用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑進一步證實，抑制Wnt/β-catenin通路活化能夠抑制丹參素對成骨細胞分化的調(diào)控。

成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收兩者間保持動態(tài)平衡是維持骨正常狀態(tài)的基礎(chǔ)。增強成骨細胞分化是抑制骨質(zhì)疏松的重要手段。本研究證實，一定濃度的丹參素可有效促進成骨細胞的分化；且丹參素促進成骨細胞的分化與激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)。本研究為闡明丹參素是否具有抗骨質(zhì)疏松作用提供了新的實驗依據(jù)。