王磊，阿地里江·阿不都拉，張富春，劉軍

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830046）

籽瓜（Citrullus lanatus ssp.vulgaris var.Megalaspermus Lin et Chao）屬葫蘆科西瓜屬，普通西瓜的變種，主要產(chǎn)于中國(guó)，分布于新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、青海等地[1-2]。新疆是籽瓜最大的種植區(qū)，是農(nóng)戶(hù)增收的重要經(jīng)濟(jì)作物之一[3-4]，僅2015年新疆籽瓜種植就有600萬(wàn)畝[5-6]。籽瓜中含有豐富的維生素、多糖、果膠、L-瓜氨酸等具有保健及抗衰老，增強(qiáng)免疫力的有效成分。除此之外，籽瓜作為抗炎消暑品食用時(shí)，由于其含糖量低，適合高血壓、糖尿病、高血脂等人群，具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值[7]。但目前大量籽瓜均用于取籽，而剩余的95%左右的瓜瓤往往被廢棄，造成了很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。雖然有部分研究基于籽瓜活性成分已進(jìn)行，但其綜合利用率依然很低；籽瓜對(duì)酪氨酸酶抑制性的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道，故我們對(duì)其不同極性及不同制備方式提取物進(jìn)行酪氨酸酶活性抑制篩選，并對(duì)活性成分進(jìn)行分析，以期增加籽瓜綜合利用價(jià)值和附加產(chǎn)值。

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是一種普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物和人體中的一種含銅離子的多酚氧化酶類(lèi)，是定位于黑色素細(xì)胞中黑色素小體膜上的一種糖蛋白，主要負(fù)責(zé)外觀顏色[9-11]。在紫外線的照射下酪氨酸酶在特化的細(xì)胞器黑色素小體內(nèi)發(fā)生系列復(fù)雜的反應(yīng)將底物L(fēng)-酪氨酸催化生成黑色素，黑色素轉(zhuǎn)移至鄰近角質(zhì)細(xì)胞沉著后，呈現(xiàn)顏色[12-14]。酪氨酸酶作為黑色素生物合成中至關(guān)重要的酶，通常作為退黑劑的靶標(biāo)[15]。在過(guò)去的50年中，氫醌一直是治療色素沉著紊亂造成的雀斑、黑斑等皮膚疾病的黃金標(biāo)準(zhǔn)[16]，隨后又衍生出曲酸[17]、熊果苷、對(duì)苯二酚、壬二酸[18]等酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。近年對(duì)天然活性成分篩選酪氨酸酶抑制劑的研究成為熱點(diǎn)，因此籽瓜作為新疆的大宗農(nóng)作物，進(jìn)行相關(guān)研究十分必要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

籽瓜材料，2016年9月采集于新疆省阜康市上戶(hù)溝鄉(xiāng)。

L-酪氨酸、酪氨酸酶、熊果苷：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、二甲基亞砜：天津永晟精細(xì)化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃硫酸、醋酐：天津市化學(xué)試劑三廠；3，5-二硝基苯甲酸、冰醋酸、香草醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；堿式乙酸鉛：洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FreeZone冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司；京制00000246電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；D7031EASYpure II超純水儀：巴恩斯特德國(guó)際有限公司；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)海道爾夫公司；HH-SR數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；ELX808全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料制備

1.3.1.1 籽瓜瓤?jī)龈煞?、烘干粉、鮮瓤的制備

1）凍干粉

取新鮮籽瓜，清洗，去青皮和籽，籽瓜瓤打漿，紗布過(guò)濾，瓤渣、清汁分離。將清汁旋蒸濃縮（50℃～55℃，轉(zhuǎn)速≥60 r/min），濃縮后的汁與瓤渣合并，混勻。放置在培養(yǎng)皿中凍干成粉，稱(chēng)重，低溫避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

2）烘干粉

取新鮮籽瓜，清洗，將籽瓜瓤切片，于60℃烘箱中烘干，打粉稱(chēng)重，低溫避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

3）鮮瓤

鮮瓜去青皮和籽的部分為鮮瓤。

1.3.1.2 籽瓜烘干粉、凍干粉、鮮瓤水提物制備

分別取凍干粉、烘干粉、鮮瓤 100 g，以 1∶20（g/mL）料液比加入蒸餾水，于60℃水浴浸提2 h，5 000 r/min離心20 min收集上清，瓤渣繼續(xù)提取，反復(fù)提取3次合并上清液，上清經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮后真空冷凍干燥，得凍干粉、烘干粉、鮮瓤水提物浸膏備用。

1.3.1.3 籽瓜瓤?jī)龈煞鄞继嵛镏苽?/p>

分別取凍干粉 100 g 各 3 份，以 1∶20（g/mL）料液比分別加入30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇，于60℃水浴浸提2 h，5 000 r/min離心20 min收集上清，瓤渣繼續(xù)提取，反復(fù)提取3次合并上清液，將收集的上清旋轉(zhuǎn)濃縮后真空冷凍干燥，得凍干粉30%醇提物、60%醇提物、95%醇提物浸膏備用。

1.3.2 不同提取物的酪氨酸酶抑制活性測(cè)定

酪氨酸酶活性測(cè)定方法參照Baek等的研究并稍作修改[25]。

1.3.2.1 磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）

稱(chēng)取磷酸二氫鈉7.16 g，去離子水溶解，定容至100 mL，得到溶液A。稱(chēng)取磷酸氫二鈉3.12g，去離子水溶解定容至100 mL，得溶液B。分別精密量取A、B溶液各51 mL、49 mL，混合即得pH=6.8磷酸緩沖溶液。

1.3.2.2 酪氨酸酶溶液

所購(gòu)置的酪氨酸酶規(guī)格為570 U/mg，精密稱(chēng)取酪氨酸酶43.86 mg，迅速轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用磷酸緩沖液溶解并定容，4℃保存。

1.3.2.3 L-酪氨酸溶液

精密稱(chēng)取L-酪氨酸18.10 mg至50 mL容量瓶中，用磷酸緩沖液溶解并定容。

1.3.2.4 熊果苷對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取熊果苷20.20 mg，去離子水溶解，至10 mL容量瓶中定容。

1.3.2.5 樣品配制

在96孔板中配置空白組對(duì)照和樣品組，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度分別為AB、AD，再將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，迅速將孵育后空白組和樣品組測(cè)定490 nm處吸光度分別為AA、AC，按下式計(jì)算樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率。配置空白及樣品反應(yīng)液組成見(jiàn)表1。

式中：AA為空白組孵育后的吸光度值；AB為空白組孵育前的吸光度值；AC為樣品組孵育后的吸光度值；AD為樣品組孵育前的吸光度值。

表1 反應(yīng)液組成Table 1 Composition of reaction fluid

1.3.3 籽瓜瓤水提物定性定量分析

1.3.3.1 籽瓜瓤水提物定性分析

本試驗(yàn)通過(guò)雙縮脲法[19]、α-萘酚法[20]、醋酐-濃硫酸法[21]、香草醛-濃鹽酸法[22]、三氯化鋁法[23]、堿性苦味酸反應(yīng)[24]等方法，定性分析籽瓜中蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸、還原糖、多糖和甙類(lèi)、皂甙類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、酚類(lèi)化合物及鞣質(zhì)類(lèi)、甾體及三萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物、強(qiáng)心甙類(lèi)、蒽醌類(lèi)、揮發(fā)油、油脂類(lèi)、生物堿類(lèi)、內(nèi)酯、香豆素及其甙類(lèi)等成分是否存在。

1.3.3.2 籽瓜瓤主要成分定量分析

對(duì)籽瓜瓤中的糖類(lèi)、有機(jī)酸等主要成分進(jìn)行定量，液相色譜法測(cè)定果糖、葡萄糖和蔗糖，以苯酚硫酸法檢測(cè)粗多糖含量，維生素C含量通過(guò)液相色譜，流動(dòng)相為磷酸二氫鉀和十六烷基三甲基溴化銨、甲醇，流速為0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。有機(jī)酸（蘋(píng)果酸、檸檬酸）通過(guò)色譜法檢測(cè)，流動(dòng)相0.1%磷酸、甲醇，流速0.5 mL/min，210 nm下檢測(cè)。參照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)如下：GB/T 10782-2006《蜜餞通則》、GB 5009.8-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》、NY/T 2016-2011《水果及其制品中果膠含量的測(cè)定分光光度法》、GB 5009.88-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測(cè)定》、SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定苯酚-硫酸法》、GB 5009.86-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中抗壞血酸的測(cè)定》、GB 5009.157-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品有機(jī)酸的測(cè)定》。

1.3.4 籽瓜糖類(lèi)、有機(jī)酸以及配比粗多糖有機(jī)酸對(duì)酪氨酸酶的抑制活性

籽瓜糖類(lèi)、有機(jī)酸以及配比粗多糖有機(jī)酸對(duì)酪氨酸酶的抑制活性方法同1.3.2。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

GraphPrism.5.0軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（Mean±SD）方式表示，以單因素方差（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)為3次獨(dú)立重復(fù)；***p＜0.001為極顯著性差異（與對(duì)照組比較），###p＜0.001為極顯著性差異（多糖有機(jī)酸混合物與凍干粉比較），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽瓜瓤?jī)龈煞鄄煌瑯O性提取物酪氨酸酶抑制活性

籽瓜凍干粉4種提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用見(jiàn)圖1。

圖1 籽瓜瓤不同極性提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.1 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp extracted by water

由圖1知，30%醇提物、60%醇提物、95%醇提物均呈濃度依賴(lài)的方式抑制酪氨酸酶活性，但其酪氨酸酶抑制活性較弱，抑制率均低于30%；其中水提物的酪氨酸酶抑制活性最強(qiáng)，濃度為50 mg/mL時(shí)達(dá)到50%以上，效果要優(yōu)于其他3種提取物，說(shuō)明其起酪氨酸酶抑制活性的成分可能是水溶性物質(zhì)。

2.2 不同制備方式的籽瓜水提物酪氨酸酶抑制活性

凍干粉不同極性提取物酪氨酸酶抑制作用最好的是水提物，凍干成本高，因此考慮籽瓜瓤不同制備方式水提物的酶活抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比，由圖2可發(fā)現(xiàn)，烘干粉水提物酪氨酸酶抑制活性最強(qiáng)，凍干粉水提物次之，鮮瓜瓤水提物的效果最差，因此將進(jìn)一步研究加工成本較低的烘干粉水提物的抑制成分。

圖2 籽瓜瓤不同制備方式水提物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.2 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp with lyophilized and ovendry power

2.3 籽瓜瓤烘干粉水提物成分定性、定量分析

2.3.1 籽瓜烘干粉水提物成分定性分析

籽瓜瓤活性成分鑒定見(jiàn)表2。

表2 籽瓜瓤活性成分鑒定Table 2 Identification of seed-watermelon pulp ingredients

由定性結(jié)果可知，籽瓜瓤烘干粉中的活性成分至少有6種，其中多糖還原糖和有機(jī)酸含量較多，是其主要成分；除此之外還含有少量的酚類(lèi)及鞣質(zhì)、甾體及三萜、強(qiáng)心苷以及生物堿。由此表明籽瓜瓤成分較為豐富，水溶性物質(zhì)主要為糖類(lèi)、有機(jī)酸，可能是其抑制酪氨酸酶活性的主要物質(zhì)。

2.3.2 籽瓜瓤中主要成分定量分析

籽瓜瓤中主要成分定量分析見(jiàn)表3。

表3 籽瓜瓤中糖類(lèi)和有機(jī)酸定量分析Table 3 Quantitative analysis of saccharides and organic acids in seed-watermelon pulp

由定性分析可知，糖類(lèi)和有機(jī)酸是籽瓜鮮瓤中的主要成分，故分別對(duì)其進(jìn)行定量分析；籽瓜鮮瓤中糖類(lèi)檢測(cè)顯示，籽瓜鮮瓤中總糖為23.577 mg/g瓜瓤，包括葡萄糖、果糖兩種還原糖及多糖等糖類(lèi)物質(zhì)。檢測(cè)籽瓜鮮瓤中有機(jī)酸表明，維生素C含有0.035 mg/g瓜瓤，蘋(píng)果酸含量最高為3.465 mg/g瓜瓤，檸檬酸為0.266 mg/g瓜瓤，籽瓜鮮瓤有機(jī)酸為3.766 mg/g瓜瓤，其中以蘋(píng)果酸為主。

2.4 籽瓜瓤糖類(lèi)、有機(jī)酸及其混合配比對(duì)酪氨酸酶的抑制活性

2.4.1 籽瓜瓤糖類(lèi)酪氨酸酶抑制活性

籽瓜瓤糖類(lèi)對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用見(jiàn)圖3。

圖3 籽瓜瓤糖類(lèi)對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp saccharides

經(jīng)檢測(cè)籽瓜鮮瓤中葡萄糖、果糖及粗多糖含量分別為11.0、12.0、0.577 mg/mL，以籽瓜90%含水量計(jì)，故烘干粉中的物質(zhì)含量均以鮮瓤的10倍計(jì)，如圖3中葡萄糖、果糖、粗多糖對(duì)酪氨酸酶抑制活性測(cè)定結(jié)果所示；籽瓜瓤粗多糖有一定的酪氨酸酶活性抑制作用，其濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL時(shí)，隨濃度增高抑制活性均在5%左右，同熊果苷的酪氨酸酶抑制活性具有顯著差異，說(shuō)明籽瓜瓤粗多糖酪氨酸酶抑制活性不顯著；從圖3看出葡萄糖和果糖呈現(xiàn)一定的負(fù)值，表明葡萄糖、果糖具有微弱的促進(jìn)酶活作用，因此籽瓜瓤糖類(lèi)可能不是抑制酶活的主要成分。

2.4.2 籽瓜瓤有機(jī)酸酪氨酸酶抑制活性

根據(jù)已測(cè)籽瓜鮮瓤有機(jī)酸的含量，對(duì)酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 籽瓜瓤有機(jī)酸對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp organic acids

圖4表明籽瓜瓤中的維生素C、蘋(píng)果酸、檸檬酸及其復(fù)合有機(jī)酸（含量為3.8 mg/mL）均對(duì)酪氨酸酶抑制活性較弱；以烘干籽瓜瓤中有機(jī)酸濃度為38 mg/mL，按其濃度遞增，依次檢測(cè)其酶活抑制作用發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸隨濃度增加具有良好的酶活抑制效果，且抑制活性略高于熊果苷，同熊果苷已無(wú)顯著差異；因此籽瓜成分中的有機(jī)酸可能為抑制酶活的主要活性成分。為進(jìn)一步研究籽瓜瓤中糖類(lèi)和有機(jī)酸與抑制酪氨酸酶活性的關(guān)系，故需對(duì)混合配比后的糖類(lèi)有機(jī)酸抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行確定。

2.4.3 配比多糖有機(jī)酸酪氨酸酶抑制活性

根據(jù)籽瓜鮮瓤中多糖和有機(jī)酸的含量，以150 mg/mL濃度的烘干籽瓜粉水提物為參照，將其含量分別為1.0 mg/mL和5.7 mg/mL的多糖與有機(jī)酸進(jìn)行混合配比，測(cè)定其酪氨酸酶抑制活性結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 籽瓜瓤多糖和有機(jī)酸對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.5 Inhibition of tyrosinase activity of seed-watermelon pulp saccharides and organic acids

由圖5可發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)酪氨酸酶抑制活性小于有機(jī)酸，兩者配比混合溶液抑制酪氨酸酶的活性均好于其對(duì)應(yīng)的單一溶液，說(shuō)明籽瓜中的多糖和有機(jī)酸均具有一定的酪氨酸酶活抑制作用，有機(jī)酸效果好于多糖；兩者配比混合溶液同烘干籽瓜粉水提物及熊果苷溶液對(duì)酪氨酸酶活性抑制率相比具有顯著差異，進(jìn)一步說(shuō)明籽瓜除有機(jī)酸是烘干籽瓜粉中酶活抑制的主要成分外，還應(yīng)存在其它酪氨酸酶活抑制成分；而150 mg/mL濃度的烘干籽瓜粉溶液同熊果苷溶液對(duì)酪氨酸酶活性抑制率類(lèi)似，無(wú)顯著差異。因此說(shuō)明烘干籽瓜粉水提物作為酪氨酸酶抑制物與熊果苷具有類(lèi)似效果，其中的有機(jī)酸和多糖僅是籽瓜抑制酪氨酸酶活性的部分成分。

3 結(jié)論與討論

由于傳統(tǒng)藥食資源中含有的天然活性成分毒副作用小、安全性高，比化學(xué)合成的抑制劑具有更大優(yōu)勢(shì)，因此近年來(lái)逐漸成為酪氨酸酶抑制劑研究者的關(guān)注熱點(diǎn)。研究表明，天然植物中的活性成分多可作為酪氨酸酶抑制劑[25-27]?！侗静菥V目》記載“籽瓜性味甘”、“籽瓜而入心脾胃，內(nèi)有解心脾胃熱，止消溫”，自古以來(lái)就是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值的農(nóng)產(chǎn)品[28-29]。而且近幾年有學(xué)者對(duì)籽瓜中多糖、果膠、多酚以及皂苷等化合物進(jìn)行了提取及抗氧化、抗腫瘤、降血糖功效的研究[30-34]，表明籽瓜瓤中多糖和多酚類(lèi)物質(zhì)具有一定的抗氧化活性，對(duì)屬于多酚氧化酶類(lèi)的酪氨酸酶來(lái)說(shuō)，其催化L-酪氨酸生成黑色素為一個(gè)氧化的過(guò)程[35]，因此多糖和酚類(lèi)均具有潛在的抑制酪氨酸酶活作用。本文研究顯示籽瓜烘干粉水提物抑制酪氨酸酶活性最強(qiáng)，其主要成分為糖類(lèi)和有機(jī)酸，進(jìn)一步定量分析后表明其中粗多糖具有酪氨酸酶活抑制作用，同已有研究結(jié)論相似，單糖對(duì)酪氨酸酶活性則具有促進(jìn)作用；而籽瓜瓤中的有機(jī)酸則表現(xiàn)出較強(qiáng)的酪氨酸酶活抑制作用，其中維生素C的抑制作用與已有研究[17-18]結(jié)果一致，蘋(píng)果酸和檸檬酸也有一定的酪氨酸酶活抑制作用；對(duì)籽瓜烘干粉水提物對(duì)應(yīng)混合配比研究后表明，籽瓜烘干粉水提物具有與熊果苷類(lèi)似的酪氨酸酶活抑制效果，但其抑制率遠(yuǎn)好于其有機(jī)酸和多糖的混合配比溶液，表明其主要的抑制酪氨酸酶活的成分除籽瓜多糖、維生素C、蘋(píng)果酸和檸檬酸外，還應(yīng)含有其它成分；而籽瓜中含有的少量酚類(lèi)及鞣質(zhì)、甾體及三萜、強(qiáng)心苷以及生物堿依然值得我們關(guān)注，這為深入籽瓜抑制酪氨酸酶活性成分探索提供了參考數(shù)據(jù)和方向。本研究表明籽瓜瓤作為一種潛在的酪氨酸酶活性抑制劑應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)業(yè)具有巨大潛力，且本處理方法簡(jiǎn)單便捷，大規(guī)模應(yīng)用后即避免了籽瓜瓤對(duì)土地污染和資源浪費(fèi)，又可提升其綜合利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

目前，對(duì)于植物天然活性成分中篩選酪氨酸酶抑制劑的研究逐漸增多，其中黃酮和酚類(lèi)物質(zhì)為多[15，35]，有機(jī)酸中的維生素C更是一種公認(rèn)的酪氨酸酶抑制劑[36]，且本研究也揭示了籽瓜中有機(jī)酸具有較好的酪氨酸酶抑制作用；但現(xiàn)有大部分研究只停留在某一類(lèi)物質(zhì)的體外酪氨酸酶抑制活性探究，并未分離純化其確切是何種物質(zhì)，或進(jìn)行深入的作用機(jī)理研究。所以，對(duì)烘干籽瓜粉的酪氨酸酶抑制作用還需要進(jìn)一步研究其所有成分并深入探討抑制機(jī)制，才可能對(duì)籽瓜大規(guī)模的深加工提供全面的理論支撐。