范治云，譚會(huì)萍，李志坤，陳峰，祝清芬

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101；2.濟(jì)南市第三人民醫(yī)院，山東濟(jì)南250132）

三七（Panaxnotoginseng）為五加科人參屬植物，已有600年以上的藥用歷史，其根、莖、葉、花均可入藥。其含有皂苷、三七素、多糖、黃酮等多種成分，藥理作用主要體現(xiàn)在對(duì)血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)等的影響[1-2]；西洋參（Panax quinquefolium L.）亦為五加科人參屬植物，其含有人參皂苷、多糖、氨基酸等多種有效成分，在抗腫瘤、心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫、代謝、抗氧化方面具多種藥理活性[3]；黃芪（Astragalus membranaceus）是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌之功效，其主要活性成分黃芪甲苷具有調(diào)節(jié)免疫、缺血保護(hù)、心臟保護(hù)、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等作用[4-5]。三七參芪膠囊是以三七、西洋參、黃芪為主要原料，經(jīng)粉碎、混合等工藝而制成的保健食品，根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）對(duì)三七參芪膠囊進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)及緩解體力疲勞的功能的初步研究[6]，為其在緩解體力疲勞功能方面保健產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 受試物

三七參芪膠囊（規(guī)格：0.45 g/粒；性狀：透明硬膠囊；內(nèi)容物為淺黃色粉末）：由某生物制藥有限公司提供。保存條件：陰涼干燥處保存。保質(zhì)期：24個(gè)月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株

ICR小鼠（SPF級(jí)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20140007）：濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境：屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)：SYXK（魯）20130012。溫度：20℃～26℃，日溫差≤3℃，濕度：40%～70%，換氣次數(shù)：≥10次/h。照明時(shí)間：12 h明暗交替。

Ames試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株 TA97、TA978、TA100 和TA102：購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 儀器與試劑

BP 211D電子天平：德國(guó)Sartorius公司；GHP-9270型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；XSC-小鼠恒溫游泳池：安徽正華儀器有限公司；電子秒表：深圳市惠波工貿(mào)有限公司；7180型全自動(dòng)生化分析儀：日本日立公司；TDZ5-WS型離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；SBA-70A乳酸儀：山東省科學(xué)院生物儀器公司；代謝活化系統(tǒng)（S9，批號(hào)3516）：上海寶錄生物科技有限公司；肝糖原試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.4 方法[6]

1.4.1 毒理學(xué)試驗(yàn)

1.4.1.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選擇體重18 g～22 g小鼠20只，雌雄各10只。按最大耐受劑量法（test of maximum tolerated dose，MTD）進(jìn)行，經(jīng)口灌胃給予最大濃度為0.34 g/mL的受試物混懸液20 mL/kg bw，1日3次，劑量合計(jì)20 g/kg bw，觀察14 d，記錄中毒體征及死亡情況。

1.4.1.2 Ames試驗(yàn)

TA97、TA98、TA100 和 TA102 4 種試驗(yàn)菌株經(jīng)鑒定符合鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型的各項(xiàng)特性，采用平板摻入法，共設(shè)5個(gè)劑量組，劑量分別為0.008、0.04、0.2、1.0、5.0 mg/皿，另設(shè)陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照組。分別在加或不加S9混合液條件下以平板摻入法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)菌株每個(gè)劑量均設(shè)3個(gè)平行皿，經(jīng)37℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)，計(jì)算各組平均菌落數(shù)。

1.4.1.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

選擇體重25 g～30 g的小鼠50只，按體重隨機(jī)分為 5組，分別為 1.7、3.4、6.8 g/kg bw 3個(gè)劑量組，另設(shè)溶媒對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組經(jīng)口灌胃給予環(huán)磷酰胺（40 mg/kg bw），溶媒對(duì)照組給予同等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。采用30 h給藥法，常規(guī)取胸骨制片、固定、染色，計(jì)算微核細(xì)胞率，及嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞比值（PCE/NCE）。

1.4.1.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

選擇體重25 g～35 g雄性小鼠25只，按體重隨機(jī)分為1.7、3.4、6.8 g/kg bw 3個(gè)劑量組，另設(shè)溶媒對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射給予環(huán)磷酰胺（40 mg/kg bw），溶媒對(duì)照組給予同等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液。連續(xù)5 d，于首次給受試物后的第35天處死小鼠，取附睪制片，用高倍鏡對(duì)每只動(dòng)物檢查1 000個(gè)精子。記錄畸變的類型和數(shù)量，計(jì)算精子畸形發(fā)生率。

1.4.2 緩解體力疲勞功能試驗(yàn)

1.4.2.1 試驗(yàn)分組及受試物給予方式

小鼠按體重隨機(jī)分為4個(gè)試驗(yàn)大組，每大組小鼠40只，分為溶媒對(duì)照組、受試物低、中、高劑量組4個(gè)小組，每小組10只。4個(gè)試驗(yàn)大組分別用于負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、血清尿素測(cè)定、血乳酸測(cè)定、肝糖原測(cè)定試驗(yàn)。設(shè)三七參芪膠囊低、中、高劑量分別為0.45、0.9、2.7 g/kg bw，相當(dāng)于人體推薦量的 5、10、30 倍劑量。臨用前用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制相應(yīng)濃度的受試物溶液。各組小鼠灌胃體積為20 mL/kg，溶媒對(duì)照組給予同等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，每天灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.4.2.2 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

末次給予受試物30 min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深30 cm，水溫（25±1.0）℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

1.4.2.3 血清尿素測(cè)定

末次給受試物30 min后，在溫度為30℃的水中不負(fù)重游泳90 min，休息60 min后，小鼠拔眼球采全血約0.5 mL（不加抗凝劑）。置4℃冰箱約3 h，血凝固后2 000 r/min離心15 min，取血清于生化分析儀上測(cè)定尿素含量。

1.4.2.4 肝糖原測(cè)定（蒽酮法）

末次給受試物后30 min頸椎脫臼處死動(dòng)物，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取肝臟100mg左右，按糖原測(cè)試盒說明書操作。

1.4.2.5 血乳酸測(cè)定

末次給受試物30 min后，不負(fù)重在溫度為30℃的水中游泳10 min后停止，在游泳前眼內(nèi)眥各采血20 μL：游泳后立即采血 20 μL；休息 20 min 后再各采血20 μL。用乳酸儀測(cè)定血乳酸，計(jì)算血乳酸曲線下面積。

血乳酸曲線下面積計(jì)算方法：

血乳酸曲線下面積=1/2×（游泳前血乳酸值+游泳后0 min的血乳酸值）×10+1/2×（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）×20

1.4.2.6 結(jié)果判定

負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，且血乳酸、血清尿素、肝糖元3項(xiàng)生化指標(biāo)中任意兩項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性，即可判定該受試物具有緩解體力疲勞功能的作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 毒理學(xué)試驗(yàn)

2.1.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

在14 d觀察期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見中毒體征，生長(zhǎng)良好，大體解剖未見異常。雌性、雄性小鼠經(jīng)口MTD均大于20 g/kg bw，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，受試物屬無(wú)毒級(jí)。

2.1.2 Ames試驗(yàn)

三七參芪膠囊Ames試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 三七參芪膠囊Ames試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of Ames test of SanQiShenQi capsule

由表 1 可知，采用 8、40、200、1 000、5 000 μg/皿 5個(gè)劑量，受試物各劑量組在加和不加S9條件下各菌株回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，各劑量組間亦無(wú)劑量反應(yīng)關(guān)系，表明在加與不加S9條件下，受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102 4株菌株均未呈現(xiàn)遺傳毒性。

2.1.3 骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

三七參芪膠囊對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響見表2。

由表2可知，各劑量組的微核率及PCE/NCE比值與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組微核率顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 三七參芪膠囊對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響Table 2 Effect of SanQiShenQi capsule on the micronucleus rate of mice bone marrow

2.1.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

三七參芪膠囊對(duì)小鼠精子畸形率的影響見表3。

表3 三七參芪膠囊對(duì)小鼠精子畸形率的影響Table 3 Effect of SanQiShenQi capsule on the malformation rate of mice sperm

由表3可知，各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組的精子畸形率顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 緩解體力疲勞功能試驗(yàn)

2.2.1 三七參芪膠囊對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

三七參芪膠囊對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響見表4。

表4 三七參芪膠囊對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table 4 Effect of SanQiShenQi capsule on the weight loading swimming time of mice

由表4可知，低劑量組與溶媒對(duì)照組比較，負(fù)重游泳時(shí)間差異無(wú)顯著性（P＞0.05），中、高劑量組與溶媒對(duì)照組比較，負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05或P＜0.01）。提示三七參芪膠囊能明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間。

2.2.2 三七參芪膠囊對(duì)小鼠血清尿素含量的影響

三七參芪膠囊對(duì)小鼠血清尿素含量的影響見表5。

表5 三七參芪膠囊對(duì)小鼠血清尿素含量的影響Table 5 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of serum urea nitrogen in mice

由表5可知，低、中劑量組與溶媒對(duì)照組比較，血清尿素含量差異無(wú)顯著性（P＞0.05），高劑量組與溶媒對(duì)照組比較，血清尿素含量顯著降低（P＜0.01）。提示三七參芪膠囊能明顯降低小鼠的血清尿素含量。

2.2.3 三七參芪膠囊對(duì)小鼠肝糖原含量的影響

三七參芪膠囊對(duì)小鼠肝糖原含量的影響見表6。

表6 三七參芪膠囊對(duì)小鼠肝糖原含量的影響Table 6 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of liver glycogen in mice

由表6可知，低劑量組與溶媒對(duì)照組比較，肝糖原含量差異無(wú)顯著性（P＞0.05），中、高劑量組與溶媒對(duì)照組比較，肝糖原含量顯著增高（P＜0.01）。表明三七參芪膠囊能顯著提高小鼠的肝糖原水平。

2.2.4 三七參芪膠囊對(duì)小鼠血乳酸含量的影響

三七參芪膠囊對(duì)小鼠血乳酸含量的影響見表7。

表7 三七參芪膠囊對(duì)小鼠血乳酸含量的影響Table 7 Effect of SanQiShenQi capsule on the content of blood lactic acid in mice

由表7可知，低、中、高3個(gè)劑量組與溶媒對(duì)照組比較，血乳酸曲線下面積差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。提示三七參芪膠囊對(duì)小鼠血乳酸含量無(wú)顯著影響。

3 討論與結(jié)論

在急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中，未見小鼠出現(xiàn)中毒體征，雌雄小鼠經(jīng)口MTD均大于20 g/kg bw，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，表明受試物屬無(wú)毒級(jí)；通過Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性，提示受試物未顯示有遺傳毒性，表明三七參芪膠囊是安全的。

負(fù)重游泳試驗(yàn)是反應(yīng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的最直觀的指標(biāo)，游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以揭示動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞的程度。尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物。長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，血清尿素氮含量降低表明蛋白質(zhì)參與供能的比例相對(duì)減少，糖原、脂肪在運(yùn)動(dòng)中供能得到相應(yīng)加強(qiáng)。因此，血清尿素氮的含量的降低在一定程度上表征了機(jī)體抗疲勞的能力[7]。糖原是機(jī)體高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的主要能量來源，肝糖原是能量?jī)?chǔ)備的直接單位，運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大量糖原消耗，為維持血糖水平，肝糖原儲(chǔ)備量大量消耗。受試物如能增加肝糖原儲(chǔ)備量，則為機(jī)體提供更多的能量，達(dá)到抗疲勞的目的[7-8]。血乳酸是糖無(wú)氧酵解的最終產(chǎn)物，劇烈運(yùn)動(dòng)使體內(nèi)乳酸堆積而引起運(yùn)動(dòng)性疲勞，因此，血乳酸水平可反應(yīng)無(wú)氧代謝水平、疲勞的產(chǎn)生和消除速度[9-10]。

給予三七參芪膠囊30 d，中、高劑量組能明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，高劑量組能明顯降低小鼠的血清尿素含量，中、高劑量組能顯著提高小鼠的肝糖原水平。但3個(gè)劑量組對(duì)小鼠血乳酸含量無(wú)顯著影響，對(duì)乳酸代謝方面的影響需要進(jìn)一步研究。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為三七參芪膠囊具有緩解體力疲勞功能的作用，為其開發(fā)為緩解體力疲勞功能的保健產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。