曾素先 黎宗強(qiáng)

(1.南寧市江南區(qū)沙井街道辦事處水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 530045； 2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

隨著近年來靈長類動(dòng)物醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的快速發(fā)展，對(duì)實(shí)驗(yàn)用猴的數(shù)量需求增多的同時(shí)對(duì)質(zhì)量的要求也越來越高，但是隨著人類活動(dòng)范圍的擴(kuò)大和捕獵的增多，野生靈長類動(dòng)物的棲息地不斷減少，數(shù)量則日趨減少，因此對(duì)籠養(yǎng)猴進(jìn)行人工繁殖來補(bǔ)充科學(xué)實(shí)驗(yàn)用猴的數(shù)量已經(jīng)十分迫切[1,2 ]。雖然性激素調(diào)控著大多數(shù)哺乳動(dòng)物的交配能力，但在靈長類動(dòng)物中性激素對(duì)性行為的控制力已經(jīng)被削弱，甚至不起作用了[3]。因此靈長類動(dòng)物的第二性征性的維持是主要由性激素完成[4]。靈長類動(dòng)物無需性激素控制性行為的表現(xiàn)，使靈長類動(dòng)物的性行為的表現(xiàn)受其社會(huì)環(huán)境和個(gè)體的社會(huì)經(jīng)歷的影響成為可能，因此性激素將對(duì)個(gè)體的交配動(dòng)機(jī)產(chǎn)生影響[5,6]，基于廣西地區(qū)食蟹猴資源豐富，取材方便，立足于有效利用食蟹猴資源的研究和推進(jìn)靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室需求的需要，文章探討廣西地區(qū)人工飼養(yǎng)食蟹猴不同順位的生殖激素的變化特征，為了解食蟹猴的生殖激素分泌特點(diǎn)提供重要的基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 研究動(dòng)物

選用廣西瑋美生物科技有限公司飼養(yǎng)的2歲4月齡、2歲10月齡、3歲9月齡的健康雌性食蟹猴各2只，單籠飼養(yǎng)，并分別編組為A、B、C三組；同樣選用2歲11月齡、3歲2月齡、3歲10月齡的健康雄性食蟹猴各2只，單籠飼養(yǎng)，并分別編組為E、F、G三組，采集血清樣本時(shí)間共150天。

利用攻擊—屈服對(duì)研究群6只雌性食蟹猴在連續(xù)6個(gè)月間的社會(huì)等級(jí)確定結(jié)果表明：研究期間食蟹猴在群體中雌性個(gè)體等級(jí)關(guān)系即順位高低依次為C2、C1、B2、B1、A2、A1；研究群體中雄性個(gè)體等級(jí)關(guān)系即順位高低依次為G1、F1、F2、G2、E1、E2。

1.2 設(shè)備與儀器

放射性計(jì)數(shù)儀(美國PE公司生產(chǎn)的1450，有Y計(jì)數(shù)、閃爍計(jì)數(shù)和發(fā)光測定的功能)，低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，恒溫水浴鍋(英國Grant公司)，超純水裝置(美國Millipore公司)，微型振蕩儀(江蘇其林貝爾儀器制造有限公司)，低溫冰箱(瑞典伊萊克斯公司)，-86℃超低溫冰箱(美國Forma公司)，超低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器設(shè)備廠)等。

1.3 主要試劑

試劑盒：雌二醇(E2)和睪酮(T)放免試劑盒(購自北方生物技術(shù)研究所)，100管/盒，2～8℃保存，按試劑盒使用說明書操作。

閃爍液：1200-436 OPTI HISAFE 2 型閃爍液，由中國同位素公司代理銷售。

1.4 血樣采集和處理

1.4.1 血樣的采集 經(jīng)過順位確認(rèn)的食蟹猴單籠單只飼養(yǎng)第10天開始采集血樣，采血部位為隱大靜脈，采血量為3.5ml/次，每隔15天采血樣一次，采集血樣時(shí)間均為每天早上7：00-8：00。

1.4.2 血樣的處理 采集的血樣在4℃環(huán)境下靜置2h，然后以3000r/m離心10min，將上清液置于3.5ml凍存管中，并對(duì)凍存管進(jìn)行標(biāo)號(hào)，放置-85℃的冰箱保存。

1.5 血樣生殖激素濃度的測定方法

分別在廣西醫(yī)科大學(xué)放免室和廣西大學(xué)動(dòng)物繁殖研究所進(jìn)行血樣測定。采用放射免疫測定法(RIA)分別檢測血樣中雌二醇(E2)和睪酮(T)含量。具體檢測方法和程序均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，全部血樣進(jìn)行雙管檢測。

1.5.1 血樣激素含量的計(jì)算方法 ①Logit值計(jì)算方法：各血樣和標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的logit值用公式計(jì)算：

Logit=Ln{(B/B0%)/(100-(B/B0%))}

②百分結(jié)合率計(jì)算方法：各血樣計(jì)數(shù)為B，并設(shè)S0管的計(jì)數(shù)為B0，其中空白管為NSB，利用如下公式計(jì)算：

B/B0(%)={B(cpm)-NSB(cpm)}/(B0-NSB)×100%

1.5.2 制定激素標(biāo)準(zhǔn)曲線 設(shè)定橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)濃度log值，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的logit，進(jìn)行繪圖后合成標(biāo)準(zhǔn)直線，據(jù)此獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：Y=aX+b

血樣濃度計(jì)算方法：通過測定血樣的計(jì)數(shù)，并利用上述血樣激素含量的計(jì)算方法計(jì)算樣品的logit值和百分結(jié)合率，最后根據(jù)logit值制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得血樣的激素濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所測雌二醇(E2)和睪酮(T)濃度值均用平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用SPSS17.1統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析程序進(jìn)行各類數(shù)據(jù)間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 廣西地區(qū)人工飼養(yǎng)雌性食蟹猴在不同順位之間雌二醇的含量

表1 雌性食蟹猴雌二醇分泌與順位的關(guān)系(pg/ml)

檢驗(yàn)組間差異顯著情況(從上到下順位依次下降)

2.2 廣西地區(qū)人工飼養(yǎng)雌性食蟹猴不同順位之睪酮含量

表2 雌性食蟹猴睪酮分泌與順位的關(guān)系(ng/ml)

檢驗(yàn)組間差異顯著情況(從上到下順位依次下降)

2.3 廣西地區(qū)人工飼養(yǎng)雄性食蟹猴不同順位個(gè)體睪酮分泌水平

表3 雄性食蟹猴睪酮分泌與順位的關(guān)系(ng/ml)

檢驗(yàn)組間差異顯著情況(從上到下順位依次下降)

3 分析與討論

根據(jù)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果，廣西地區(qū)人工籠養(yǎng)雌性食蟹猴不同順位間雌二醇分泌水平差異較大，但是雌二醇濃度并沒有隨著個(gè)體順位由高到低或者是由低到高而呈一致性的變化，順位高，雌二醇濃度不一定高，相反，順位低也并不意味著雌二醇濃度低。C1與B1、B2、A1、A2睪酮的分泌量差異極顯著(P<0.01)，與C2睪酮的濃度分泌量差異不顯著(P>0.05)，B1與B2、A2差異顯著(P<0.05)，與其他組差異極顯著(P<0.01)。廣西地區(qū)人工飼養(yǎng)雌性食蟹猴不同順位間睪酮分泌水平差異很大，但是睪酮濃度并沒有隨著個(gè)體順位又高到低或者是由低到高而呈一致性的變化，順位高者(C1、C2)，睪酮濃度也高，但是順位低也并不意味睪酮濃度依次降低，B2睪酮的濃度小于順位低的B1，B1睪酮的濃度小于順位低的A1睪酮分泌量。雄性食蟹猴不同順位個(gè)體的睪酮分泌量之間差異極顯著(P<0.01)，個(gè)體食蟹猴睪酮的分泌量不是隨著順位的升高和降低而升高和降低的，由表可知F1、F2的順位高于G2，而睪酮的分泌量低于G2，說明順位高的個(gè)體睪酮的分泌量不一定高于順位低的個(gè)體睪酮的分泌量，順位低的個(gè)體睪酮的分泌量也不一定低于順位高的個(gè)體。

雌二醇的釋放由中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，在短時(shí)間內(nèi)分泌量變化較大是它的特點(diǎn)[7]。在排卵前期E2分泌量可達(dá)最高峰，隨后逐漸減退，青年組食蟹猴正處在生理旺盛的時(shí)期，爭奪配偶的欲望較為強(qiáng)烈，這或許提示是性激素分泌濃度支配的結(jié)果。本試驗(yàn)中雌二醇在順位之間差異顯著，其中順位低的B2雌二醇的含量為170.23±25.23ng/ml，高順位的C2的含量為97.94±15.33 ng/ml.據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雌性食蟹猴的卵巢功能全年都有周期性變化，但在不同的月份和不同的順位和年齡，其雌二醇和孕酮的分泌水平均有極顯著的差異。靈長類中，高序位雌性開始繁殖的時(shí)間較早[8]。社會(huì)性動(dòng)物中的社會(huì)等級(jí)影響到發(fā)情狀態(tài)[9]。本研究中，C1、C2、B1在等級(jí)中處于優(yōu)勢地位。

人們對(duì)非人靈長類動(dòng)物中順位對(duì)其生殖機(jī)能的影響的機(jī)制尚不夠清晰，但是研究表明，腎上腺皮質(zhì)素的分泌差異對(duì)生殖機(jī)能的影響是一個(gè)重要的原因[10]。但是本研究結(jié)果顯示雄性食蟹猴睪酮濃度與順位關(guān)系不是完全符合上述研究結(jié)果，G1睪酮濃度大于低順位的F1、F2，而順位低于F1、F2的G2的睪酮濃度高于它們，從而說明雄性食蟹猴睪酮分泌水平受到年齡和順位的共同制約。任寶平等[4]在報(bào)道：雄性川金絲猴血清中的睪酮分泌量與群體的穩(wěn)定性有一定的關(guān)系；本研究群體中C1是處在最高順位，所以睪酮的分泌量最高，但是C2的順位低與B1、B2個(gè)體，而睪酮的分泌量高于它們，這種情況與野性黃山短尾猴結(jié)果一直，可能是由于低順位個(gè)體在群體中情緒緊張、遭受攻擊等促使睪酮分泌[10]。

在靈長類中，性行為的表現(xiàn)往往不但受性激素調(diào)控外，還會(huì)受到社群結(jié)構(gòu)、等級(jí)排序等的影響[11]。C1處于在順位的第一位，享有取食的優(yōu)先權(quán)和交配權(quán)，它的睪酮的濃度明顯高于C2、B1、B2、A1、A2，這可能是高等級(jí)猴受高性激素濃度支配的結(jié)果，社群等級(jí)地位越高其性激素濃度也會(huì)越高，攝食能力強(qiáng)，爭奪配偶能力越強(qiáng)，因而其后代保存機(jī)率越高，因此其較高繁殖率以及高傳遞率可以保證高品質(zhì)后代在社群中占優(yōu)勢，有利于種群的繁衍[12]。

本試驗(yàn)是人工飼養(yǎng)的情況下，解決了樣品在野外采集時(shí)間不易控制，并選擇正確的血液處理和保存方法以確保樣品中生殖激素的水平不受影響。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，由于食蟹猴體型小，懼怕人類抓捕，而采血過程的抓捕行為可能引起食蟹猴產(chǎn)生較大應(yīng)激，因此血樣的采集時(shí)間不能太過于集中，不然也許會(huì)影響試驗(yàn)的效果；另外，本試驗(yàn)中使用的試驗(yàn)動(dòng)物食蟹猴較為珍貴，動(dòng)物養(yǎng)殖場無法大量提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物偏少，所以本次結(jié)果只是反映了廣西地區(qū)人工飼養(yǎng)條件下食蟹猴生殖激素水平變化的大體趨勢，更精確的研究有待進(jìn)一步研究完善。