曾璐嵐，史紅俠，祁興磊，林鳳鵬，黃永震，藍(lán)賢勇，陳 宏，雷初朝﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.渭南市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 渭南 714000；3. 河南省泌陽縣畜牧局，河南 泌陽 463700)

夏南牛是以夏洛萊牛為父本，南陽牛為母本，經(jīng)導(dǎo)入雜交，橫交固定，和自群繁育三個(gè)階段的開放式育種培育而成的肉牛新品種[1]。其中南陽牛的血統(tǒng)占到62.5%，而夏洛萊牛血統(tǒng)占37.5%。夏南牛作為我國第一個(gè)專門化肉牛培育品種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、生長發(fā)育快、易育肥、產(chǎn)肉率高、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。

Y 染色體遺傳信息是對常染色體、X 染色體及線粒體 DNA 信息重要的補(bǔ)充。哺乳動(dòng)物的Y染色體遵循父系遺傳，單倍型完整，突變率低，不易受重組和回復(fù)突變等因素的影響，是研究動(dòng)物父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史的理想工具。近年來，基于Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)的分子遺傳研究表明，家牛具有Y1、Y2和Y3三種Y染色體單倍型組，其中Y1和Y2代表普通牛起源，Y3代表瘤牛起源[2]，而這兩種分子標(biāo)記的結(jié)合使用能夠更準(zhǔn)確、精細(xì)地反映家牛Y染色體的起源歷史[3-8]。

然而，迄今為止，關(guān)于夏南牛這一優(yōu)良的肉用培育品種在分子水平上的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和父系起源的未見報(bào)道。本研究利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記結(jié)合分析夏南牛的父系起源、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，為今后開展該品種的選育策略制定和保種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

在河南省泌陽縣夏南?？萍奸_發(fā)有限公司共采集32頭夏南牛公牛耳組織帶回實(shí)驗(yàn)室，采用基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA，稀釋終濃度至 10～20 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照Edwards等[2]、趙曉誠[3]和Li等[7]發(fā)表的2個(gè)家牛Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)引物信息和家牛2個(gè)經(jīng)典的Y-STR位點(diǎn)，即INRA189和BM861標(biāo)記的引物信息(詳見表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

表1 家牛Y染色體特異性標(biāo)記引物信息

25 μL PCR體系：2×Prime STAR Max Premix(上海寶生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水12.5 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃變性10 sec，Ta℃退火15 sec，72℃延伸10 sec，35個(gè)循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.3 測序、單倍型組分型及單倍型多樣度計(jì)算

將PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA測序儀(Applied Biosystems公司)進(jìn)行正、反向測序，測序結(jié)果用Chromas2.3軟件進(jìn)行核實(shí)和校正，得到每個(gè)夏南牛公牛個(gè)體的2個(gè)Y-SNP標(biāo)記的序列多態(tài)性及2個(gè)Y-STR標(biāo)記的分型數(shù)據(jù)，確定不同個(gè)體的Y染色體單倍型，最后用Arlequin3.5軟件計(jì)算群體單倍型多樣度 (H±SD)。

2 結(jié)果與分析

通過對32頭夏南牛2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)記都沒有檢測到多態(tài)性，其中UTY-19標(biāo)記存在C>A核苷酸顛換，而ZFY-10標(biāo)記存在T>C轉(zhuǎn)換和1個(gè)GT核苷酸插入/缺失多態(tài)位點(diǎn)(表2)。參照趙曉誠等[3]和常振華等[8]的家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明：32頭夏南牛全部為Y2單倍型組，所占頻率為100%。說明夏南牛只有一種普通牛Y2父系起源。

利用2個(gè)家牛Y-STRs標(biāo)記INRA189和BM861檢測夏南牛32頭公牛的Y染色體遺傳多態(tài)性，結(jié)果表明，2個(gè)標(biāo)記在32頭夏南牛中各檢測到1個(gè)等位基因，無多態(tài)性。在INRA189座位中，夏南牛的等位基因大小為102 bp；在BM861座位中檢測到夏南牛的等位基因大小為158 bp(表2)。

結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記結(jié)果，參考Edwards[2]和Li[7]的單倍型判定標(biāo)準(zhǔn)(Y-SNP-INRA189-BM861)，在32頭夏南牛中確認(rèn)僅存在1種Y染色體單倍型，即 Y2-102-158，其單倍型多樣度為0。

表2 夏南牛Y染色體單倍型頻率及多樣度

3 討論

近年來，家牛 Y-SNPs 標(biāo)記被廣泛用于世界牛品種/群體的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)等研究。Y染色體分子標(biāo)記是追溯家牛起源、馴化歷史和遷徙路線的重要工具，可揭示家牛的父系遺傳多樣性及群體間父系介導(dǎo)的雜交情況。家牛有3種父系起源(即普通牛Y1和Y2單倍型組以及瘤牛Y3單倍型組)，Y-SNPs可以區(qū)分這3種單倍型組，而Y-STRs標(biāo)記可將Y1、Y2和Y3所具有的豐富的單倍型進(jìn)行精細(xì)區(qū)分[2-8]。

利用Y-SNPs 標(biāo)記，對蒙古、日本和韓國 3 個(gè)國家的牛品種研究表明[9]，這些國家的牛品種只擁有普通牛 Y 染色體單倍型組，未檢測到瘤牛單倍型組。隨后，Edwards 等[2]通過分析 138 個(gè)歐洲和亞洲牛品種發(fā)現(xiàn)，歐洲牛只擁有普通牛 Y 染色體單倍型組。其中 Y1 主要出現(xiàn)在北歐和西北歐，但也出現(xiàn)在多個(gè)伊比利亞牛品種和西南亞牛品種中；瘤牛 Y3 單倍型組則主要在亞洲西南部。

而在國內(nèi)部分黃牛(包括普通牛和瘤牛)品種的父系遺傳分析中，常振華等[8]和Li 等[7]對中國 16 個(gè)地方黃牛品種進(jìn)行了父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及起源分析，結(jié)果一致表明北方黃牛以 Y2 單倍型組為主，南方黃牛以 Y3 單倍型組為主，中原黃牛含普通牛 Y2 和瘤牛Y3 單倍型組。同時(shí)，Li 等[7]還發(fā)現(xiàn)哈薩克、秦川、吉安 3 個(gè)黃牛品種除以 Y2 或 Y3 單倍型組為主外，還含有少量普通牛 Y1 單倍型組個(gè)體。

本研究中，我們首次使用 2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對 32 頭夏南牛進(jìn)行了父系遺傳多樣性分析，研究顯示夏南牛在上述 2 個(gè)標(biāo)記上都無多態(tài)性，說明其父系遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定、單一。夏南牛的父本為夏洛萊牛，Edwards等[2]研究發(fā)現(xiàn)夏洛萊牛屬于Y2單倍型組，而根據(jù)2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記結(jié)果顯示夏南牛也全部由普通牛Y2 單倍型組構(gòu)成，即僅有1個(gè)父系起源，說明我們的研究結(jié)果與夏南牛的培育歷史相一致。